腺相關(guān)病毒系統(tǒng)pAAV-LacZ pAAV-IRES-hrGFP pCMV-MCS. BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心
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腺相關(guān)病毒(AAV)簡介-BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心
腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。
簡介：
重組腺相關(guān)病毒載體是利用天然存在的腺相關(guān)病毒某些特性經(jīng)過基因工程改造后產(chǎn)生的一種可供人工轉(zhuǎn)基因的載體。腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是簡單的非致病性單鏈DNA病毒，需要輔助病毒參與生活周期，輔助病毒通常為腺病毒(Ad)或者單純皰疹病毒(HSV)。基因組兩端為末端反向重復序列(ITR)，中間基因組編碼兩個蛋白：Cap和Rep。ITRs對于病毒的復制和包裝具有決定性作用。Cap蛋白為病毒衣殼蛋白，Rep蛋白參與病毒的復制和整合。AAV能感染多種細胞。Rep蛋白存在時，病毒基因組很容易整合到人類第19號染色體的特異位點：AAVS1位點。這是已知的唯一能夠定點整合的哺乳動物DNA病毒。
重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。
特點：
優(yōu)點：以潛伏感染為主；AAV可以高效定點整合至人染色體中：可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達。
缺點：AAV載體容量小，目前最多只能容納4.5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會引起免疫排斥。
重組腺病毒相關(guān)載體構(gòu)建：
AAV選擇的條件：
1.治療基因的長度不能過大。AAV的總?cè)萘?.5kb，還要包括AAV自身的ITR，啟動區(qū)和RNA加尾信號；
2.基因需要持續(xù)表達，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；
3.長期表達目的基因，沒毒副作用；
4.不需要目的基因立刻表達；
5.不需要基因高水平表達；
6.AAV載體對靶細胞具有較高的轉(zhuǎn)導效率。
AAV病毒的感染細胞
AAV載體對于骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細胞、心臟平滑肌細胞、神經(jīng)元細胞、胰島B細胞、關(guān)節(jié)滑膜細胞等具有良好的感染效果，而對于淋巴細胞、造血干細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、成纖維細胞等感染效果較差。
腺病毒相關(guān)載體應用：
經(jīng)過十幾年的研究，重組腺相關(guān)病毒的生物學特性已被深入了解，尤其是其在各種細胞、組織和體內(nèi)實驗中的應用效果方面已經(jīng)積累了許多資料。在醫(yī)學研究中，rAAV被用于多種疾病的基因治療的研究(包括體內(nèi)、體外實驗)；同時作為一種有特點的基因轉(zhuǎn)移載體，還廣泛用于基因功能研究、構(gòu)建疾病模型、制備基因敲除鼠等方面。目前已發(fā)現(xiàn)的AAV至少有十幾種血清型，它們主要區(qū)別在衣殼蛋白Cap的不同，因此導致各種血清型AAV對不同的組織和細胞的不同感染效率。目前普遍認為，rAAV是最為優(yōu)秀可用于基因治療的重組病毒載體。
特點
優(yōu)點
缺點
腺病毒相關(guān)載體構(gòu)建
AAV選擇的條件
AAV病毒的感染細胞
病毒的加樣量
病毒要求
病毒級別
腺病毒相關(guān)載體應用
腺相關(guān)病毒屬微小病毒( parvovirus)家族的成員，為無包膜的單鏈線狀DNA病毒。AAV的基因組約4700bp?；蚪M5‘、3’端各有一個145nt的反向末端重復序列（ITR）。在兩個ITR之間存在兩個開放閱讀框，其中Rep基因參與病毒的復制和整合，Cap基因編碼病毒衣殼蛋白。
圖1 AAV病毒基因組
腺相關(guān)病毒具有安全性高、免疫原性低、能介導基因在動物體內(nèi)長期穩(wěn)定表達，因而被認為是最有潛力成為基因治療工具的載體而在國內(nèi)外研究中廣泛應用。
應用優(yōu)勢：動物和臨床試驗
AAV進入細胞前，首先要通過衣殼蛋白與細胞表面的相應受體結(jié)合，進而附著于細胞表面，隨后通過衣殼蛋白與其它復合受體的相互作用來起始病毒顆粒的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等生物學活動。AAV不同血清型有不同的衣殼蛋白，進而可與不同的細胞表面受體結(jié)合，體現(xiàn)出血清型對不同組織器官的不同親和性。在包裝腺相關(guān)病毒時有9種不同的AAV血清型可供客戶選擇，建議客戶針對不同組織器官選擇相應血清型的AAV病毒，見下表。
AAV載體不同血清型
研究發(fā)現(xiàn)AAV 具有多種血清型，各種不同血清型的AAV 載體的主要區(qū)別是衣殼蛋白不同，因此對不同的組織和細胞的轉(zhuǎn)染效率存在差異。目前Biovector NTCC保藏中心在包裝腺相關(guān)病毒時有 12種不同的 AAV 血清型可供客戶選擇，建議客戶針對不同組織器官選擇相應血清型的 AAV 病毒，見表 2。
表1. 12種不同血清型AAV對各組織器官細胞的親和性
血清型 | 組織親和性 |
AAV1 | 肌肉，心臟，骨骼肌（包括心?。窠?jīng)組織 |
AAV2 | 中樞神經(jīng)，肌肉，肝臟，腦組織，眼， |
AAV3 | 肌肉，肝臟，肺，眼 |
AAV4 | 中樞神經(jīng)，肌肉，眼，腦 |
AAV5 | 肺，眼，中樞神經(jīng)，關(guān)節(jié)滑膜，胰腺 |
AAV6 | 肺，心臟 |
AAV7 | 肌肉，肝臟 |
AAV8 | 肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉 |
AAV9 | 心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經(jīng) |
DJ | 肝臟，視網(wǎng)膜，肺，腎臟 |
DJ/8 | 肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉 |
Rh10 | 肺, 心臟，肌肉，中樞神經(jīng)，肝臟 |
AAV生物學特性
表2 不同病毒的生物學特性比較
慢病毒 | 逆轉(zhuǎn)錄病毒 | 腺相關(guān)病毒 | 腺病毒 | |
包膜 | 有 | 有 | 無 | 無 |
顆粒直徑 | 90-100 nm | 90-100 nm | 20-30 nm | 60-90nm |
基因組 | dsRNA | dsRNA | ssDNA | dsDNA |
表達起始時間 | 48-72h | 48-72h | 72-96h | 24-48h |
表達持續(xù)時間 | > 2 months | > 2 months | > 6 months | ~1 month |
宿主基因組整合方式 | 隨機高頻整合 | 隨機高頻整合 | 定向低頻整合或非整合 | 非整合 |
常用質(zhì)粒：
腺相關(guān)病毒可用于基因的過表達（3kb以下）、shRNA（單條或者多條串聯(lián)）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）、可誘導表達。腺相關(guān)病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP等多種啟動子可供選擇，常用載體如下表。
載體名稱 | 包裝容量 | 載體用途 |
pAAV-CMV-MCS | <3kb | 過表達 |
pAAV-CMV-MCS-ZsGreen | <2.2kb | 過表達 |
pAAV-CMV-MCS-IRES-ZsGreen | <1.7kb | 過表達 |
pAAV-CMV-MCS-IRES-mCherry | <1.7kb | 過表達 |
pAAV-CAG-MCS | <2.4kb | 過表達 |
pAAV-CAG-IRES-ZsGreen | <1.2kb | 過表達 |
pAAV-ZsGreen-ShRNA | N/A | ShRNA |
pAAV-tdTomato-ShRNA | N/A | ShRNA |
pAAV-CMV-ZsGreen-miRNA | N/A | miRNA |
pAAV-CMV-ZsGreen-MCS | N/A | 過表達/miRNA |
pAAV-MCS Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng)
pAAV-RC Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng)
pHelper Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng)
pAAV-LacZ Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng)
pAAV-IRES-hrGFP Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng)
pCMV-MCS Stratagene 腺相關(guān)病毒系統(tǒng)
pAAV-MCS | 過表達AAV載體 |
pAAV-EGFP | GFP標記，空白AAV質(zhì)粒 |
pAAV-ZsGreen | GFP標記，空白AAV質(zhì)粒 |
pAAV-tdTomato | RFP標記，空白AAV質(zhì)粒 |
pAAV-ZsGreen-ShRNA | RNAi AAV載體，帶GFP標記 |
pAAV-tdTomato-ShRNA | RNAi AAV載體，帶RFP標記 |
pAAV-IRES-hrGFP | 過表達AAV載體，帶GFP標記 |
pAAV-IRES-ZsGreen | 過表達AAV載體，帶GFP標記 |
pAAV-IRES-tdTomato | 過表達AAV載體，帶RFP標記 |
pAAV-hRK1-IRES-ZsGreen | 過表達AAV載體，帶GFP標記，帶RK1啟動子 |
pHelper | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒 |
pAAV2/1 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型1型 |
pAAV2/2 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型2型 |
pAAV2/3 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型3型 |
pAAV2/4 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型4型 |
pAAV2/5 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型5型 |
pAAV2/6 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型6型 |
pAAV2/7 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型7型 |
pAAV2/8 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型8型 |
pAAV2/9 | AAV系統(tǒng)質(zhì)粒，血清型9型 |
pDC316-mCMV-EGFP | 過表達腺病毒載體，帶GFP標記 |
pDC316-mCMV-ZsGreen | 過表達腺病毒載體，帶GFP標記 |
pDC316-mCMV-tdTomato | 過表達腺病毒載體，帶RFP標記 |
pDC316-EGFP-ShRNA | RNAi 腺病毒載體，帶GFP標記 |
pDC316-ZsGreen-ShRNA | RNAi 腺病毒載體，帶GFP標記 |
pBHG(△E1，E3) | Ad5型腺病毒系統(tǒng)質(zhì)粒 |
pBGN-ShRNA1 | RNAi腺病毒表達載體，帶GFP標記 |
pBGN-ShRNA2 | RNAi腺病毒表達載體，帶GFP標記 |
pBGN-ShRNA3 | RNAi腺病毒表達載體，帶GFP標記 |
pBGN-ShRNA4 | RNAi腺病毒表達載體，帶GFP標記 |
pBGN-ShRNA | RNAi表達載體，帶GFP標記 |
pBGN-MiRNA | microRNA表達載體，帶GFP標記 |
pBRN-ShRNA | RNAi表達載體，帶RFP標記 |
pBIGN-ShRNA | RNAi表達載體及過表達載體，帶GFP標記 |
另外，BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心提供腺病毒系統(tǒng)（
AAV應用介紹
A. AAV9感染小鼠腦組織（PMID: 23503602）
B. AAV2感染大鼠腦組織
C. AAV2感染腎臟（PMID: 23216315）
D. AAV感染心臟（PMID: 20703310）
E. AAV9感染骨骼肌（PMID: 21811247）
F. AAV感染肝臟（PMID: 19861950）
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