BioVector? TMNK-1 人正常肝竇內(nèi)配細胞永生化株 / BioVector? TMNK-1 Immortalized Human Normal Sinusoidal Endothelial Cell Line

1 細胞基本信息與培養(yǎng)表型 / Cell Identification and Morphological Profiling

• 細胞名稱 (Cell Name)：BioVector? TMNK-1 人正常肝竇內(nèi)皮細胞永生化株 (BioVector? TMNK-1 Immortalized Human Normal Sinusoidal Endothelial Cell Line)

• 組織來源 (Tissue Origin)：人類正常肝臟組織（通過轉(zhuǎn)導(dǎo)人類大 T 抗原 Simian Virus 40 large T antigen / SV40T 基因成功打破海弗里克極限，建立的長效非腫瘤源性永生化人肝竇內(nèi)皮細胞系。該細胞在無限增殖的同時，高度保留了微血管內(nèi)皮細胞特有的窗孔結(jié)構(gòu)與屏障攝取表型）。

• 生長特性 (Growth Properties)：嚴(yán)格貼壁生長 (Strictly Adherent)。

• 細胞形態(tài) (Cell Morphology)：典型的長梭形、不規(guī)則形或長多角形上皮/內(nèi)皮樣（Endothelial-like）。細胞在低密度栽培時呈現(xiàn)舒展的偽足，高密度匯合后形成極其致密的單層網(wǎng)狀“鋪路石狀”排列，且表現(xiàn)出明顯的接觸抑制特性。(Presents distinct elongated, spindled, endothelial-like single-cell tracks, developing tightly packed mesh-like cobblestone formations upon saturation.)

• 安全等級 (Biosafety Level)：2 級安全控制（BSL-2，因含有 SV40T 永生化病毒片段，僅限體外科研使用，嚴(yán)禁用于臨床人類細胞治療或再生醫(yī)學(xué)制劑制備）。

2 分子細胞生物學(xué)特征與肝臟微環(huán)境屏障模型價值 / Molecular Dynamics and SEC Validation

BioVector? TMNK-1 細胞株是全球肝臟纖維化（Liver Fibrosis）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝竇阻塞綜合征（SOS）以及腫瘤肝轉(zhuǎn)移微環(huán)境研究中應(yīng)用最廣泛的國際標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)皮屏障替代模型：

The BioVector? TMNK-1 cellular platform preserves robust physiologic expression profiles governing human sinusoidal clearance and filtration networks, serving as a high-fidelity, non-tumorigenic alternative to unstable primary liver sinusoidal endothelial cells (LSEC):

內(nèi)皮特異性標(biāo)志物與功能受體高豐度表達 (Conservation of Endothelial Profiles)

與外周大血管內(nèi)皮細胞（如 HUVEC 臍靜脈內(nèi)皮細胞）截然不同，BioVector? TMNK-1 細胞在良性栽培環(huán)境下能夠高水平維持肝竇內(nèi)皮細胞（LSEC）特有的清道夫受體與屏障標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄活性：

• 核心內(nèi)皮質(zhì)控紅線 (Endothelial Biomarkers)：穩(wěn)定表達人類最核心的內(nèi)皮剪切標(biāo)志物 CD31（PECAM-1）、vWF（血管性血友病因子）。

• 肝竇內(nèi)皮特異性受體 (LSEC-Specific Scavenger Markers)：高水平表達具有特征性的 穩(wěn)定蛋白-2（Stabilin-2） 以及 LYVE-1（淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1）。這使得該細胞系具備對胞外透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid）以及變性膠原的高效內(nèi)吞與清除功能，是評估肝纖維化進程中肝竇“毛細血管化（Capillarization）”退行性變的核心窗口。(Stably expresses native master endothelial determinants including CD31, vWF, and specialized LSEC-specific markers like Stabilin-2 and LYVE-1 to dictate sinusoidal lineage fidelity.)

3 細胞完全培養(yǎng)基配方與防變性貼壁維持規(guī)范 / Routine Culturing and Matrix Stabilization Specifications

核心紅線規(guī)程 / Matrix-Coating and Adherence Warning

TMNK-1 細胞作為高度特異化的微血管內(nèi)皮細胞，其貼壁性能與表面接觸力學(xué)高度依賴外源胞外基質(zhì)。嚴(yán)禁將其直接接種在未經(jīng)任何修飾的裸塑料培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿上，否則會導(dǎo)致細胞發(fā)生自發(fā)性收縮變圓、大面積浮空并成批老化死亡。在復(fù)蘇或傳代接種前的 45 分鐘，必須強制使用 BioVector? Extracellular Matrix Fibronectin（高純度人/牛血漿纖連蛋白包被液） 或 BioVector? Collagen I（鼠尾 I 型膠原蛋白） 對所有培養(yǎng)器皿表面進行無菌涂布預(yù)處理。此外，為了防止細胞在連續(xù)單層栽培中丟失內(nèi)皮分化表型，換液和消化必須使用經(jīng)過嚴(yán)格篩選、富含內(nèi)皮特定生長因子的專屬完全培養(yǎng)基。(TMNK-1 cells will fail to adhere and undergo swift death on non-coated plastic grids. Pre-coat all vessels using BioVector? Fibronectin or Collagen I solution for 45 minutes, and execute programmatic passages cleanly at 85% confluence to block lineage drift.)

基礎(chǔ)與完全培養(yǎng)基組分配方 / Complete Feeding Matrix Formulation

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (Base Medium)：BioVector? Premium Endothelial Cell Basal Medium（高級內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基）。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有嚴(yán)格校準(zhǔn)的血管生長因子本底適應(yīng)線。

• 完全培養(yǎng)基配方與特異性內(nèi)皮補劑添加 (Complete Culture Media & Supplements)：

  • BioVector? Endothelial Basal Medium：89%

  • BioVector? Premium Fetal Bovine Serum（內(nèi)皮細胞專用特級胎牛血清 / FBS）：10%（該血清群經(jīng)批次質(zhì)控，確保促纖維化變異本底降至最低線）。

  • BioVector? Endothelial Cell Growth Supplements (內(nèi)皮細胞專用生長因子復(fù)配添加劑 / 100X)：1%（內(nèi)含精密配比的內(nèi)皮生長因子 VEGF、堿性成纖維細胞生長因子 bFGF、肝素等，用以鎖定其正常肝竇內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)錄分化表型）。

  • BioVector? Certified Penicillin-Streptomycin（優(yōu)質(zhì)雙抗補劑）：1%

• 基質(zhì)膠包被液 (Coating Substrate)：BioVector? Extracellular Matrix Fibronectin (纖連蛋白)，工作濃度通常為 1-2 ug/cm2（用無菌 PBS 稀釋后加入瓶中，37 攝氏度孵育 45 分鐘，接種前吸除多余液體即可）。

標(biāo)準(zhǔn)物理培養(yǎng)環(huán)境 (Incubation Parameters)

• 氣體與溫度控制 (Atmospheric Setup)：標(biāo)準(zhǔn)恒溫加濕孵箱，設(shè)定運行溫度為 37 攝氏度，連續(xù)輸入 5% 二氧化碳 ($\text{CO}_2$)。

4 細胞凍存管復(fù)蘇、連續(xù)傳代與冷凍保存工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 階段：細胞庫凍存管的復(fù)蘇啟動 / Phase A: Cryovial Thawing

1. 提前對 T25 細胞培養(yǎng)瓶 進行 BioVector? Fibronectin 表面包被，處理完畢后在超凈臺內(nèi)放置備用。

2. 從液氮罐氣相層中小心移出 BioVector? TMNK-1 細胞凍存管，立刻完全浸沒在 37 攝氏度恒溫水浴鍋中高頻快速晃動，在 1 到 2 分鐘內(nèi)徹底融化。

3. 在無菌超凈臺內(nèi)，將融化的細胞懸液緩慢注入含有 5 mL 預(yù)熱的 BioVector? 內(nèi)皮完全培養(yǎng)基的 15 mL 無菌離心管中。

4. 以 1000 乘以 g 離心 4 分鐘，徹底倒掉含有高濃度 DMSO 毒性的舊上清液。

5. 加入 5 mL 新鮮的內(nèi)皮完全培養(yǎng)基輕柔重懸細胞沉淀，平穩(wěn)接種至預(yù)先包被好的 T25 瓶中，移入孵箱栽培。

B 階段：日常貼壁細胞傳代操作 / Phase B: Subculturing Method

1. 當(dāng)瓶內(nèi)貼壁細胞覆蓋密度達到 80% 至 85% 匯合度（呈現(xiàn)致密的密接內(nèi)皮樣單層）時，必須啟動傳代。切勿讓細胞達到 100% 滿瓶狀態(tài)過夜，否則細胞會因高度擠壓接觸抑制而迅速老化死亡或發(fā)生自發(fā)性內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）。

2. 吸除舊完全培養(yǎng)基。使用無菌的 BioVector? PBS（不含鈣鎂平衡鹽洗滌液） 輕柔潤洗細胞層 1 次。

3. 向原培養(yǎng)瓶中加入 1.0 mL BioVector? Trypsin-EDTA（0.25% 傳統(tǒng)工程胰蛋白酶消化液）。置于 37 攝氏度孵箱中消化 1 到 2 分鐘。

4. 鏡下終止紅線：消化期間需密切在顯微鏡下盯防。一旦發(fā)現(xiàn)細胞邊緣收縮、變圓并有大面積松動跡象，立刻加入雙倍體積的預(yù)熱完全培養(yǎng)基終止消化。用血清槍輕柔吹打瓶壁 3 次。傳代比例嚴(yán)格限定在 1比2 到 1比3 之間，分配接種到新包被的無菌培養(yǎng)瓶中。

C 階段：高品質(zhì)細胞凍存株建立 / Phase C: Safe Cryopreservation

1. 收集處于對數(shù)生長最旺盛、內(nèi)皮形態(tài)完好的低代次 TMNK-1 細胞沉淀。

2. 配制高級細胞凍存基質(zhì)液，推薦組分為：BioVector? Endothelial Basal Medium（55%）+ BioVector? Premium FBS（35%）+ BioVector? Cryo-Grade DMSO（10%）；或直接選用一體化無菌型的 BioVector? Cellular Cryopreservation Medium 專用無血清快速凍存液。

3. 調(diào)整細胞重懸密度至 2 乘以 10^6 到 4 乘以 10^6 個細胞/mL，分裝入微量無菌凍存管。放入 BioVector? Programmed Cooling Container（細胞程序降溫盒） 中，立刻移入零下 80 攝氏度冰箱放置過夜。24 小時內(nèi)必須將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐（零下 196 攝氏度）中進行長期冷凍儲存。

5 支原體監(jiān)控與 CD31 標(biāo)志物高豐度維持一票否決制質(zhì)控紅線 / Downstream Quality Control Metrics

支原體污染紅線熔斷消殺 (Mycoplasma Surveillance)

TMNK-1 細胞作為微血管內(nèi)皮模型，一旦發(fā)生隱性支原體（Mycoplasma）污染，支原體的內(nèi)源代謝毒素會強烈干擾內(nèi)皮緊密連接復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障通透性大面積人為惡化，使科研藥篩數(shù)據(jù)完全失真。必須每 4 周對細胞進行支原體 PCR 篩查。

使用 BioVector? Mycoplasma PCR Detection Kit（支原體高靈敏 PCR 檢測試劑盒） 擴增上清。一旦電泳檢測在目標(biāo)區(qū)間出現(xiàn)陽性污染條帶，必須立即執(zhí)行紅線熔斷消殺：徹底將該污染批次的細胞瓶高壓滅菌（121 攝氏度），并對孵箱等全部空間使用 BioVector? Mycoplasma Disinfectant Spray（支原體專用高效消殺噴劑） 進行多輪飽和噴灑，隨后重新復(fù)蘇原始低代次無污染種子細胞。(Any trace contamination resolved by the BioVector? Mycoplasma PCR Kit commands a comprehensive red-line system shutdown: autoclave running lines at 121 degrees Celsius and disinfect the environmental footprints with BioVector? Mycoplasma Disinfectant Spray.)

內(nèi)皮核心標(biāo)志物 CD31 表達本底一票否決制質(zhì)控紅線 (CD31 Expression QC Metric)

為了確證對外交付或?qū)嶒炦\行的 BioVector? TMNK-1 細胞株沒有發(fā)生由于過量傳代、惡性內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）引發(fā)的“表型退化行為”，質(zhì)控部門或研究人員必須在栽培傳代每超過 8 代時，提取細胞總蛋白質(zhì)，平行執(zhí)行經(jīng)典的特異性功能質(zhì)控：

1. 檢測方法：使用 BioVector? 蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)（Western Blot） 或流式細胞術(shù)，測定細胞表面核心內(nèi)皮分化標(biāo)志物 CD31（PECAM-1） 的相對空間表達豐度，并與代表成纖維/間質(zhì)退化的標(biāo)志物 波形蛋白（Vimentin） 進行比對。

2. 合格交付核心紅線指標(biāo)：在正常的完全培養(yǎng)基栽培狀態(tài)下，該細胞系的內(nèi)皮分化表型必須呈現(xiàn)極其干凈的強陽性特征，其經(jīng)條帶灰度換算的 CD31 蛋白表達豐度與內(nèi)源內(nèi)參的灰度比值必須恒定大于或等于 0.50。這一高水平分泌本底是確證其保留正常人肝竇內(nèi)皮細胞系身份的一票否決標(biāo)準(zhǔn)。

3. 一票否決處理規(guī)范：一旦 Western Blot 定量檢測發(fā)現(xiàn)該 CD31 蛋白表達灰度比值跌破 0.50 門檻線，確證該批次內(nèi)皮細胞已發(fā)生不可逆的表型退化或脫分化。該生產(chǎn)或?qū)嶒炁渭毎麍?zhí)行一票否決紅線制，全盤作廢徹底滅菌銷毀，絕對禁止對外交付或用于后續(xù)下游任何肝微環(huán)境生理數(shù)據(jù)的實驗收集。必須立刻重新從液氮冷凍庫中復(fù)蘇低代次、形態(tài)完好的原始種子克隆重新進行擴增。(Enforce a rigid, non-negotiable protein-level expression gatekeeper: the quantified functional band intensity of CD31 molecules over control housekeeping tracks must stay consistently at or above the threshold line of 0.50. If the profile drops below this functional metric line during routine verification, it indicates target endothelial decay; invoke the absolute system veto to dump the active flasks instantly and restart the SEC expansion loops from early-passage cryopreserved master seeds.)

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