BioVector? Fa2N-4 人正常肝樣細胞永生化株 / BioVector? Fa2N-4 Immortalized Human Normal Hepatocyte-like Cell Line

1 細胞基本信息與培養(yǎng)表型 / Cell Identification and Morphological Profiling

• 細胞名稱 (Cell Name)：BioVector? Fa2N-4 人正常肝樣細胞永生化株 (BioVector? Fa2N-4 Immortalized Human Normal Hepatocyte-like Cell Line)

• 組織來源 (Tissue Origin)：人類正常肝臟組織（通過轉(zhuǎn)導人類大 T 抗原 Simian Virus 40 large T antigen / SV40T 基因成功打破海弗里克極限，建立的長效非腫瘤源性永生化人正常肝細胞系。該細胞在無限增殖的同時，高度保留了原代人肝細胞特有的藥物代謝酶系與分泌表型）。

• 生長特性 (Growth Properties)：嚴格貼壁生長 (Strictly Adherent)。

• 細胞形態(tài) (Cell Morphology)：典型的多角形上皮樣（Epithelial-like）。細胞體積較大，胞質(zhì)內(nèi)富含密集的顆粒狀細胞器，核大而圓且?？梢婋p核現(xiàn)象，高密度匯合后呈現(xiàn)經(jīng)典的“鋪路石狀”排列。(Presents large, polygonal, epithelial-like single-cell tracks with rich, granular cytoplasm and distinct multinucleation, developing tightly packed cobblestone formations upon saturation.)

• 安全等級 (Biosafety Level)：2 級安全控制（BSL-2，因含有 SV40T 永生化病毒片段，僅限體外科研使用，嚴禁用于臨床人類細胞治療或再生醫(yī)學制劑制備）。

2 分子細胞生物學特征與藥物代謝誘導模型價值 / Molecular Dynamics and ADME Validation

BioVector? Fa2N-4 細胞株是全球新藥臨床前研發(fā)、早期藥物代謝動力學（ADME）、體外肝毒性（Hepatotoxicity）高通量初篩中應用最廣泛的國際標準化正常人肝細胞替代模型：

The BioVector? Fa2N-4 cellular platform preserves robust physiologic expression profiles governing human hepatic clearance networks, serving as a high-fidelity, non-tumorigenic alternative to unstable primary human hepatocytes (PHH):

完整的細胞色素 P450 (CYP450) 酶系與轉(zhuǎn)運體本底 (Conservation of Phase I/II Enzyme Cascades)

與常規(guī)的肝癌細胞（如 HepG2 極度喪失藥代酶功能）截然不同，BioVector? Fa2N-4 細胞在良性栽培環(huán)境下能夠高水平維持第一相和第二相藥物代謝酶的轉(zhuǎn)錄與功能活性：

• 核心 CYP 酶譜功能 (Active CYP Isoforms)：穩(wěn)定表達人類最核心的藥物清除酶，包括 CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 以及最具一票否決制的 CYP3A4。

• 酶誘導特異性應答 (Enzyme Induction Profiles)：該細胞保留了經(jīng)典的核受體調(diào)控網(wǎng)絡（如 PXR、CAR 和 AhR）。當受到外源標準誘導劑利福平（Rifampicin）或苯巴比妥（Phenobarbital）刺激時，能誘發(fā)下游 CYP3A4 蛋白表達量呈數(shù)倍至數(shù)十倍的特異性亢進反應。

• 血漿蛋白與解毒分泌 (Hepatic Secretory Competency)：內(nèi)源性持續(xù)穩(wěn)定合成并分泌人類白蛋白（Albumin）以及尿素（Urea），高度模擬天然肝小葉肝細胞的同質(zhì)化代謝排毒功能。(Maintains key metabolic and clearancy features including human serum albumin synthesis, robust urea conjugation, and fully responsive CYP3A4 enzyme induction cascades via active PXR/CAR transcriptional machinery.)

3 細胞完全培養(yǎng)基配方與防脫落包被維持規(guī)范 / Routine Culturing and Matrix Stabilization Specifications

核心紅線規(guī)程 / Matrix-Coating and Adherence Warning

Fa2N-4 細胞分化程度極高，貼壁性能對基質(zhì)環(huán)境極度敏感。嚴禁將其直接接種在未經(jīng)任何修飾和包被的普通塑料培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿上，否則會導致細胞發(fā)生自發(fā)性懸浮、聚集老化并成批壞死崩潰。在復蘇或傳代接種前的 45 分鐘，必須強制使用 BioVector? Extracellular Matrix Collagen I（高純度抗體級/常規(guī)級鼠尾 I 型膠原蛋白包被液） 對所有培養(yǎng)皿表面進行無菌涂布預處理。此外，為了維持其高度分化的 CYP 酶系本底不發(fā)生“去分化退化”，必須完全禁止使用普通的高糖或低糖 DMEM，必須全程強制依賴專用的無血清分化維持培養(yǎng)基系統(tǒng)。(Fa2N-4 cells will fail to adhere and undergo swift apoptotic death on non-coated plastic grids. Pre-coat all vessels using BioVector? Collagen I solution for 45 minutes, and strictly avoid common DMEM formulas in favor of specialized serum-free hepatocyte formulations.)

基礎與完全培養(yǎng)基組分配方 / Complete Feeding Matrix Formulation

• 基礎培養(yǎng)基 (Base Medium)：BioVector? MFE Specialized Hepatocyte Serum-Free Medium（MFE 專屬肝細胞無血清支持基礎培養(yǎng)基）。該基礎培養(yǎng)基具有嚴格校準的微量元素平衡線。

• 完全培養(yǎng)基配方與特異性補劑添加 (Complete Culture Media & Supplements)：

  • BioVector? MFE Base Medium：98%

  • BioVector? Fa2N-4 Specialized Culturing Hormone Supplements (Fa2N-4 細胞專用激素及生長因子復配補劑 / 100X)：1%（內(nèi)含精密配比的去氫皮質(zhì)酮、胰島素、人表皮生長因子 EGF 等，用以鎖定其正常人肝樣細胞的轉(zhuǎn)錄分化表型）。

  • BioVector? Certified Penicillin-Streptomycin（優(yōu)質(zhì)雙抗補劑）：1%

• 基質(zhì)膠包被液 (Coating Substrate)：BioVector? Extracellular Matrix Collagen I (I 型膠原蛋白)，工作濃度通常為 5 ug/cm2（用無菌 0.02 M 乙酸或無菌 PBS 稀釋后加入瓶中，37 攝氏度孵育 45 分鐘，接種前用無菌 PBS 潤洗 2 次）。

標準物理培養(yǎng)環(huán)境 (Incubation Parameters)

• 氣體與溫度控制 (Atmospheric Setup)：標準恒溫加濕孵箱，設定運行溫度為 37 攝氏度，連續(xù)輸入 5% 二氧化碳 ($\text{CO}_2$)，空氣相對濕度恒定維持在 95% 以上。

4 細胞凍存管復蘇、連續(xù)傳代與冷凍保存工作流 / Thawing, Passage, and Cryopreservation Workflows

A 階段：細胞庫凍存管的復蘇啟動 / Phase A: Cryovial Thawing

1. 提前對 T25 細胞培養(yǎng)瓶 進行 BioVector? Collagen I 表面包被，處理完畢后在超凈臺內(nèi)放置備用。

2. 從液氮罐氣相層中小心移出 BioVector? Fa2N-4 細胞凍存管，立刻完全浸沒在 37 攝氏度恒溫水浴鍋中高頻快速晃動，在 1 到 2 分鐘內(nèi)徹底融化。

3. 在無菌超凈臺內(nèi)，將融化的細胞懸液緩慢注入含有 5 mL 預熱的 BioVector? MFE 肝細胞完全培養(yǎng)基的 15 mL 無菌離心管中。

4. 以 800 乘以 g 離心 4 分鐘（該細胞體積偏大且質(zhì)地脆弱，離心轉(zhuǎn)速需適度放低），徹底倒掉含有高濃度 DMSO 毒性的舊上清液。

5. 加入 5 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基輕柔重懸細胞沉淀，平穩(wěn)接種至預先包被好的 T25 瓶中，移入孵箱栽培。

B 階段：日常貼壁細胞傳代操作 / Phase B: Subculturing Method

1. 當瓶內(nèi)貼壁細胞覆蓋密度達到 80% 至 85% 匯合度（呈現(xiàn)致密的密接上皮樣單層）時，必須啟動傳代。切勿讓細胞達到 100% 滿瓶，否則細胞會因高度擠壓接觸抑制而自發(fā)啟動不可逆的去分化或分層脫落。

2. 吸除舊完全培養(yǎng)基。使用無菌的 BioVector? PBS（不含鈣鎂平衡鹽洗滌液） 輕柔潤洗細胞層 1 次。

3. 向原培養(yǎng)瓶中加入 1.0 mL BioVector? Trypsin-EDTA（0.05% 極低濃度專用胰蛋白酶消化液）。置于 37 攝氏度孵箱中消化 2 到 3 分鐘。

4. 鏡下終止紅線：由于細胞間緊密連接極為發(fā)達，消化期間需密切在顯微鏡下盯防。一旦發(fā)現(xiàn)細胞邊緣收縮、變圓并有大面積松動跡象，立刻加入 3 mL 預熱的完全培養(yǎng)基終止消化。用血清槍極其輕柔地吹打瓶壁 3-5 次。傳代比例嚴格限定在 1比2 到 1比3 之間，分配接種到新包被的無菌培養(yǎng)瓶中。

C 階段：高品質(zhì)細胞凍存株建立 / Phase C: Safe Cryopreservation

1. 收集處于對數(shù)生長最旺盛、上皮形態(tài)完好的低代次 Fa2N-4 細胞沉淀。

2. 配制高級無血清專用細胞凍存液，推薦組分為：BioVector? MFE Base Medium（80%）+ BioVector? Cryo-Grade DMSO（10%）+ BioVector? High-Purity Bovine Serum Albumin（10% 高純度牛血清白蛋白作為大分子保護劑）；或直接選用一體化無菌無血清型的 BioVector? Cellular Cryopreservation Medium 專用凍存液。

3. 調(diào)整細胞重懸密度至 2 乘以 10^6 到 3 乘以 10^6 個細胞/mL，分裝入微量無菌凍存管。

4. 將凍存管放入 BioVector? Programmed Cooling Container（細胞程序降溫盒） 中，立刻移入零下 80 攝氏度冰箱放置過夜。24 小時內(nèi)必須將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐（零下 196 攝氏度）中進行長期冷凍儲存。

5 白蛋白分泌本底與支原體隱性污染一票否決制質(zhì)控紅線 / Downstream Quality Control Metrics

支原體污染紅線熔斷消殺 (Mycoplasma Surveillance)

Fa2N-4 細胞一旦發(fā)生隱性支原體（Mycoplasma）污染，其胞內(nèi)的 PXR/CAR 核受體基因鏈會遭到徹底的表觀遺傳沉默，導致全盤喪失藥物代謝酶誘導表型，使科研藥篩數(shù)據(jù)完全失真。必須每 4 周對細胞進行支原體 PCR 篩查。

使用 BioVector? Mycoplasma PCR Detection Kit（支原體高靈敏 PCR 檢測試劑盒） 擴增上清。一旦電泳檢測在目標區(qū)間出現(xiàn)陽性污染條帶，必須立即執(zhí)行紅線熔斷消殺：徹底將該污染批次的細胞瓶高壓滅菌（121 攝氏度），并對孵箱等全部空間使用 BioVector? Mycoplasma Disinfectant Spray（支原體專用高效消殺噴劑） 進行連續(xù)多輪飽和噴灑，隨后重新復蘇原始低代次無污染種子細胞。(Any baseline verification of mycoplasma contamination triggers an immediate red-line shutdown: autoclave running lines at 121 degrees Celsius and erase the space using BioVector? Mycoplasma Disinfectant Spray.)

人類白蛋白（Human Albumin）基礎分泌率一票否決制質(zhì)控紅線 (Albumin Expression QC Metric)

為了確證對外交付或?qū)嶒炦\行的 BioVector? Fa2N-4 細胞株沒有發(fā)生由于惡性傳代、去分化、或者被惡性腫瘤細胞（如 HeLa 或普通的成纖維細胞）發(fā)生隱性交叉污染頂替，質(zhì)控部門或研究人員必須在栽培傳代每超過 8 代時，收集細胞連續(xù)培養(yǎng) 24 小時的無血清上清液，執(zhí)行經(jīng)典的定量功能質(zhì)控：

1. 檢測方法：使用 BioVector? Human Albumin ELISA Quantitation Kit（高靈敏人類白蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒），利用配套的 BioVector? 多功能分光光度酶標儀 測定上清液中人類白蛋白的絕對分泌質(zhì)量分值，并根據(jù)貼壁細胞總數(shù)進行標準化換算。

2. 合格交付核心紅線指標：在正常的無血清分化維持培養(yǎng)基栽培狀態(tài)下，該細胞系的 人類白蛋白（Human Albumin）基礎分泌速率必須恒定大于或等于 1.5 ug / (10^6 cells · 24 hours)。這一高水平分泌本底是確證其保留正常人肝細胞系身份的一票否決標準。

3. 一票否決處理規(guī)范：一旦 ELISA 定量檢測發(fā)現(xiàn)該白蛋白基礎分泌速率跌破 1.5 ug 的紅線門檻，甚至測定值趨近于零，確證該批次肝樣細胞已發(fā)生嚴重的表型退化去分化，或者已經(jīng)發(fā)生了外源非肝源性細胞的交叉污染。該發(fā)酵生產(chǎn)批次細胞執(zhí)行一票否決紅線制，嚴禁向外交付或進入任何 ADME 毒理實驗數(shù)據(jù)收集。必須立刻對當前運行的細胞瓶全盤高壓滅菌消殺，并徹底追溯清洗消殺所有可能受污染的培養(yǎng)環(huán)境，重新從液氮冷凍庫中復蘇 pristine 原始代次的無污染種子冷凍管起步擴增。(Enforce a rigid, non-negotiable protein-level secretion gatekeeper: the quantified functional output of human albumin in the cellular supernatants must stay consistently at or above the threshold line of 1.5 ug per million cells over a 24-hour cycle. If the expression rate drops below this functional metric line, it signals an immediate cell-line decay or identity cross-contamination; invoke the absolute system veto to dump the active flasks instantly and restart the hepatocyte expansion loops from early-passage cryopreserved master seeds.)

BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌株細胞蛋白抗體基因保藏中心

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