BioVector? TR-iBRB2 Rat Conditionally Immortalized Retinal Capillary Endothelial Cell Line / BioVector? TR-iBRB2 大鼠條件永生化視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞株（血-視網(wǎng)膜屏障內(nèi)層屏障模型）

一 產(chǎn)品基本信息與分子生物學(xué)背景

• 細(xì)胞株/品系別名：TR-iBRB2、TR-iBRB 2克隆、FERM BP-6507。

• 生物學(xué)來(lái)源：大鼠（Rattus norvegicus，Wistar轉(zhuǎn)基因大鼠品系）。

• 細(xì)胞形態(tài)與組織譜系：貼壁型成纖維細(xì)胞樣/梭形內(nèi)皮細(xì)胞（Fibroblastic/Spindle Endothelial Monolayer）。源自大鼠眼部原位視網(wǎng)膜微血管毛細(xì)血管內(nèi)皮。

• 雙階條件永生化作用機(jī)制（The Dual-State $tsA58$ Switch）：

  TR-iBRB2是由日本金澤大學(xué)（Ken-ichi Hosoya團(tuán)隊(duì)）與東北大學(xué)（Tetsuya Terasaki團(tuán)隊(duì)）建立的經(jīng)典屏障模型。它提取自攜帶溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原突變基因（$tsA58$ SV40 large T-antigen）的轉(zhuǎn)基因大鼠組織。大T抗原的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)活性直接受到外部培養(yǎng)溫度的物理調(diào)控，展現(xiàn)出獨(dú)特的“雙相開關(guān)”：

  • 增殖/永生化狀態(tài)（Permissive Window，33 ℃）：在 33 ℃ 較低溫度下培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)出高活性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的 SV40 大 T 抗原。該抗原持續(xù)抑制宿主抑癌基因（如 p53 和 Rb），促使內(nèi)皮細(xì)胞規(guī)避 Hayflick 極限，表現(xiàn)出極強(qiáng)的體外分裂增殖與高效傳代能力（倍增時(shí)間約 19 - 21 小時(shí)）。

  • 分化/高功能狀態(tài)（Non-Permissive Window，37 ℃ - 39 ℃）：當(dāng)將環(huán)境溫度上調(diào)至 37 ℃ 或 39 ℃ 時(shí)，溫敏型 $tsA58$ 蛋白會(huì)發(fā)生自發(fā)性的構(gòu)象熱變性失活。大 T 抗原的沉默促使細(xì)胞立即退出細(xì)胞周期，停止分裂，并迅速啟動(dòng)生理學(xué)成熟分化，展現(xiàn)出與在體（in vivo）完全一致的血-視網(wǎng)膜內(nèi)層屏障（Inner Blood-Retinal Barrier, iBRB）的轉(zhuǎn)運(yùn)體功能與緊密連接網(wǎng)。

二 核心科研價(jià)值與血-視網(wǎng)膜屏障（iBRB）藥理學(xué)模型

TR-iBRB2 是目前國(guó)際上公認(rèn)研究“血液-視網(wǎng)膜屏障（BRB）”最為核心和標(biāo)準(zhǔn)化的體內(nèi)外替代（in vitro）模型工具：

                      [ 循環(huán)血液微血管側(cè) (Blood Side) ]                                      │                                      ▼             ┌──────────────────────────────────────────────────┐             │       TR-iBRB2 內(nèi)皮單層細(xì)胞屏障 (37°C 緊密分化)      │             │                                                  │             │  [GLUT1]      [OCTN2]      [system xc-]   [P-gp] │             │  (葡萄糖)     (左旋肉堿)     (L-胱氨酸)    (藥物外排)│             └────────────────────────┬─────────────────────────┘                                      │                                      ▼                       [ 視網(wǎng)膜神經(jīng)組織側(cè) (Retina Side) ]

1. 內(nèi)層血-視網(wǎng)膜屏障（inner BRB）分子轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)解析：

   視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間通過(guò)高度密集的緊密連接（Tight Junctions）限制了分子的自由擴(kuò)散。TR-iBRB2 在分化狀態(tài)下高度表達(dá)多種特異性極性轉(zhuǎn)運(yùn)體，可用于精確追蹤藥物能否穿透眼底屏障：

   • 糖轉(zhuǎn)運(yùn)體：高表達(dá) GLUT1（$Slc2a1$），具備對(duì) 3-O-甲基-D-葡萄糖（3-OMG）的飽和米氏飽和動(dòng)力學(xué)攝取特征（$K_m \approx 5.56\text{ mM}$）。

   • 肉堿與陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)：特異性搭載 OCTN2（有機(jī)陽(yáng)離子/肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)體2），負(fù)責(zé)介導(dǎo)乙酰左旋肉堿從血液向視網(wǎng)膜的定向主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

   • 抗氧化屏障：選擇性高表達(dá) System $x_c^-$ 丙氨酸-谷氨酸共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（而同期的血腦屏障 TR-BBB 細(xì)胞通常不表達(dá)），用于攝取 L-胱氨酸以對(duì)抗眼底的光誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。

2. 多藥耐藥性與排毒泵（ABC Transporters）機(jī)制：

   細(xì)胞基底膜高豐度表達(dá)約 180 KDa 的 P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp），并可通過(guò) RT-PCR 穩(wěn)定檢出 mdr1a、mdr1b 以及 mdr2 基因。這使得 TR-iBRB2 成為評(píng)估小分子眼科靶向藥是否會(huì)被眼底血管自發(fā)外排、篩選高靶向眼底穿透性前藥（Prodrugs）的經(jīng)典重磅底盤。

3. 糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）及微血管損傷模型：

   在 37 ℃ 分化后，給予 TR-iBRB2 高糖（Hyperglycemia Stress）或高炎性因子（如 Interleukin-1$\beta$, IL-1$\beta$）刺激，細(xì)胞能極好地模擬出臨床上糖尿病視網(wǎng)膜微血管斷裂、白細(xì)胞粘附（Leukostasis）、線粒體功能障礙、氧化物/活性氮（ROS/iNOS）爆發(fā)以及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等病理演變。常被用于篩選原花青素 B2（Procyanidin B2）、川芎嗪（Tetramethylpyrazine）等眼底毛細(xì)血管保護(hù)劑。

三 實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞復(fù)蘇、增殖擴(kuò)張與分化實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)流線

1. 專用培養(yǎng)基與核心包被基質(zhì)配方

TR-iBRB2 細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)具有高度依賴性，日常栽培及鋪板必須使用經(jīng)過(guò)膠原蛋白包被的容器，否則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞成纖維化漂移或大面積貼壁失敗。

• 基質(zhì)包被規(guī)范：培養(yǎng)瓶/實(shí)驗(yàn)多孔板在接種前，必須使用 I 型鼠尾膠原蛋白（Collagen Type I，推薦終濃度約為 $15 - 30\ \mu\text{g/L}$ 或按廠家指南） 鋪底包被，置于 37 ℃ 結(jié)合 2 小時(shí)后，使用無(wú)菌 PBS 洗滌 2 次方可接種。

• 完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基配置（增殖與維持通用）：

  • 基底培養(yǎng)基：高糖 DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），含 2 mM L-谷氨酸。

  • 血清品質(zhì)：10% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）（無(wú)需滅活）。

  • 促生長(zhǎng)因子：15 $\mu\text{g/L}$ 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Endothelial Cell Growth Factor, ECGF） 或 替代使用 VEGF 混劑，用以維持內(nèi)皮特征。

  • 抗生素：1% 經(jīng)典青霉素-鏈霉素雙抗。

2. 凍存細(xì)胞的快速低倍增復(fù)蘇流線（于 33 ℃ 啟動(dòng)）

1. 提前制備好膠原蛋白 I 型包被的 T25 培養(yǎng)瓶，加入 5 mL 預(yù)熱至 33 ℃ 的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)瓶置于 33 ℃、5% $CO_2$ 孵箱 中調(diào)節(jié)氣相平衡。

2. 從液氮罐中取出 TR-iBRB2 凍存管，迅速投入 33 ℃ - 37 ℃ 水浴箱中劇烈水平搖晃，在 60 - 90 秒內(nèi)完成全量融化。

3. 用 75% 酒精消毒管壁，移入超凈臺(tái)，將融化后的濃稠細(xì)胞懸液緩慢滴加到盛有 4 mL 預(yù)熱完全培養(yǎng)基的 15 mL 離心管中，極其輕柔地吹打混勻。

4. 低速離心洗滌：在 200 × g（約 1000 rpm）下低速離心 5 分鐘。

5. 棄去含有 DMSO 廢液的上清液，加入 1.5 mL 新鮮完全培養(yǎng)基（含 ECGF 因子）將細(xì)胞塊輕柔彈散，隨后全量接種到預(yù)先包被好的 T25 瓶中。

6. 蓋緊瓶蓋，置于 33 ℃ 孵箱 中靜置培養(yǎng)。24 小時(shí)后必須全量更換一次新鮮培養(yǎng)基，以徹底清除死細(xì)胞碎屑。

3. 日常增殖狀態(tài)下的傳代維護(hù)流程（33 ℃ 條件）

• 匯合度控制紅線：在 33 ℃ 擴(kuò)增擴(kuò)繁階段，必須在細(xì)胞匯合度達(dá)到 75% - 85% 時(shí)進(jìn)行傳代。切勿讓內(nèi)皮細(xì)胞在 33 ℃ 長(zhǎng)滿至 100% 溢出密度，否則密集的接觸壓力會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在低穩(wěn)態(tài)下過(guò)早啟動(dòng)部分自發(fā)分化。

• 消化操作步驟：

  1. 吸除舊培養(yǎng)基，使用不含鈣鎂離子的無(wú)菌 PBS 溶液輕柔漂洗細(xì)胞單層 1 次。

  2. 加入適量 0.05% Trypsin - 0.02% EDTA 消化液（T25 瓶通常加入 1 mL），室溫（或 33 ℃）下孵育消化。

  3. 鏡下微觀監(jiān)控：TR-iBRB2 作為微血管內(nèi)皮，對(duì)胰酶較為敏感。通常在 1 - 3 分鐘內(nèi) 細(xì)胞就會(huì)明顯回縮并圓化。一旦見輕敲瓶身細(xì)胞呈流沙狀整體滑落，應(yīng)立即加入 2 倍體積的含血清完全培養(yǎng)基終止消化。

  4. 用移液槍溫柔吹打瓶壁，使細(xì)胞分散為單細(xì)胞懸液。

  5. 200 × g 離心 5 分鐘，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸，按 1:3 到 1:4 的稀釋比例 接種到新包被的膠原底物瓶中，繼續(xù)在 33 ℃ 培養(yǎng)。

4. 屏障實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)：至 37 ℃ - 39 ℃ 的分化操作規(guī)范

當(dāng)需要將 TR-iBRB2 細(xì)胞用于跨膜藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、3-OMG 糖攝取、Transwell 電阻（TEER）測(cè)定或糖尿病高糖損傷藥效實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)執(zhí)行以下溫控分化轉(zhuǎn)換：

1. 在 33 ℃ 下收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)質(zhì) TR-iBRB2 細(xì)胞。

2. 將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所需的密度（如：Transwell 聚酯膜小室、多孔板、或鋪有玻璃玻片的膠原包被孔內(nèi)）進(jìn)行接種。

3. 完成熱休克變性轉(zhuǎn)換：將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)器具，直接放入 37 ℃ 或者是 39 ℃（根據(jù)特定分化轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)強(qiáng)度而定，37 ℃ 最為常用） 的 5% $CO_2$ 恒溫孵箱中。

4. 分化維持窗：在此非許可溫度下，SV40 大 T 抗原降解，細(xì)胞停止分裂并橫向舒展肥大，分化成緊密交織的完整血-視網(wǎng)膜內(nèi)層屏障單層。通常在 37 ℃ 持續(xù)誘導(dǎo)分化 3 - 5 天后，即可開展下游的極性藥物通透性測(cè)試或屏障毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。

5. 菌株與細(xì)胞長(zhǎng)期保存參數(shù)

• 高保護(hù)性凍存基質(zhì)配方：80% 高糖 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 10% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS） + 10% 細(xì)胞級(jí)二甲基亞砜（DMSO）。

• 冷凍與長(zhǎng)期封存流線：

  1. 必須采集處于 33 ℃ 擴(kuò)增狀態(tài)下、生長(zhǎng)極為旺盛且未長(zhǎng)滿（匯合度 ~80%） 的對(duì)數(shù)期細(xì)胞作為凍存種子（嚴(yán)禁凍存已經(jīng)處于 37 ℃ 分化定型的細(xì)胞）。

  2. 胰酶消化、離心集菌后，使用預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，將活細(xì)胞終密度控制在 $1.5 \times 10^6$ - $3.0 \times 10^6\text{ cells/mL}$。

  3. 分裝入無(wú)菌凍存管后，立刻置于標(biāo)準(zhǔn)梯度程序降溫盒中（如 Mr. Frosty），塞入 -80 ℃ 超低溫冰箱中梯度降溫過(guò)夜（確保滿足 -1 ℃/min 的溫降速率）。

  4. 24 小時(shí)內(nèi)，迅速將凍存管轉(zhuǎn)移并完全沒(méi)入液氮罐（-196 ℃）的液相層中實(shí)施永久封存。禁止在 -80 ℃ 普通冰箱中進(jìn)行超過(guò) 3 個(gè)月的長(zhǎng)期存放，以防大 T 抗原基因表達(dá)構(gòu)象發(fā)生表觀遺傳失活。

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