BioVector? N2a/APP695swe Mouse Neuroblastoma / Genetically Engineered Alzheimer's Disease Model Cell Line / N2a/APP695swe 小鼠神經(jīng)瘤/瑞典突變型APP695基因修飾阿爾茨海默病模型細(xì)胞株

一 產(chǎn)品基本信息與細(xì)胞生物學(xué)背景

• 細(xì)胞名稱：N2a/APP695swe（亦常寫(xiě)作 N2a-APPswe 或 Neuro-2a/APP695swe）。

• 物種來(lái)源：小鼠（Mus musculus），親本為 A/J 品系小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 Neuro-2a (N2a)。

• 組織源起與基因工程背景（阿爾茨海默病的核心細(xì)胞模型）：

  N2a/APP695swe 是一株在阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）發(fā)病機(jī)制以及藥物篩選研究中應(yīng)用極廣的人類疾病基因修飾型體外經(jīng)典細(xì)胞模型。其親本 Neuro-2a 是源自小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性神經(jīng)母細(xì)胞瘤，天然具備一定的神經(jīng)元分化潛能。

  為了在體外高擬真度地模擬人類 AD 的關(guān)鍵病理特征，科研人員利用真核表達(dá)質(zhì)粒，將人類淀粉樣前體蛋白 695 氨基酸異構(gòu)體（Amyloid Precursor Protein 695, APP695）且攜帶瑞典雙突變（Swedish mutation, K670N/M671L，即 Lys670Asn 和 Met671Leu）的完整 cDNA 序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至 N2a 細(xì)胞中。

  瑞典突變（Swedish Mutation）是一種經(jīng)典的家族性阿爾茨海默病（FAD）基因突變，該突變恰好位于 $\beta$-分泌酶（BACE1）對(duì) APP 的剪切位點(diǎn)上。由于氨基酸的改變，使得 BACE1 對(duì)該位點(diǎn)的剪切親和力成倍提升，導(dǎo)致 APP 異常向淀粉樣通路（Amyloidogenic pathway）傾斜。經(jīng)穩(wěn)定克隆化篩選后獲得的 N2a/APP695swe 細(xì)胞，能在無(wú)需外源添加的情況下，自發(fā)、穩(wěn)定且高水平地向培養(yǎng)基外大量分泌淀粉樣蛋白 $\beta$（主要包括 $A\beta_{1-40}$ 和極具細(xì)胞毒性的 $A\beta_{1-42}$）。

• 核心表型與細(xì)胞生物學(xué)特征：

  • 形態(tài)學(xué)表現(xiàn)：貼壁生長(zhǎng)。在未分化的基礎(chǔ)狀態(tài)下，細(xì)胞呈阿米巴樣、多角形或短紡錘形，伴有少量極短的原始胞質(zhì)突起。當(dāng)通過(guò)血清撤藥（Serum withdrawal）或添加分化誘導(dǎo)劑（如定量的全反式維甲酸 ATRA）時(shí)，細(xì)胞有向神經(jīng)元表型分化的趨勢(shì)，但由于高濃度內(nèi)源性 $A\beta$ 的負(fù)反饋抑制，其突起伸展與分支能力較野生型 N2a 明顯受限。

  • 核心病理標(biāo)志物圖譜（質(zhì)控指標(biāo)）：

    1. APP 蛋白強(qiáng)陽(yáng)性：通過(guò) Western Blot 可在約 100 - 130 kDa 處檢測(cè)到強(qiáng)烈的全長(zhǎng)人源 APP 蛋白條帶。

    2. $A\beta$ 高豐度分泌：利用 ELISA 雙抗夾心法測(cè)定培養(yǎng)上清，可穩(wěn)定富集高濃度的胞外 $A\beta_{1-40}$ 和 $A\beta_{1-42}$ 游離單體及寡聚體（Oligomers）。

    3. 伴隨性病理?yè)p傷：細(xì)胞內(nèi)部表現(xiàn)出明顯的線粒體超微結(jié)構(gòu)受損、自噬流受阻（如 p62 降解障礙、LC3-II/I 比值異常）以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等典型的 AD 細(xì)胞早期病理特征。

• 生物安全級(jí)別：2級(jí)（BSL-2）。（注：由于屬于基因重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，且多攜帶慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒整合片段，依據(jù) CDC-NIH 規(guī)范建議在 BSL-2 生物安全柜內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作）。

二 核心科研價(jià)值與阿爾茨海默病藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用

N2a/APP695swe 細(xì)胞株是串聯(lián)體外高通量實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)動(dòng)物疾病模型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化橋梁：

1. $\beta$-分泌酶（BACE1）與 $\gamma$-分泌酶抑制劑/調(diào)制劑的高通量藥效篩選：

   該細(xì)胞是評(píng)估小分子化學(xué)藥或天然產(chǎn)物是否具有“抗 AD 活性”的核心靶盤(pán)。通過(guò)向孔板內(nèi)投放化合物，直接定量檢測(cè)培養(yǎng)基上清中 $A\beta_{1-40}/A\beta_{1-42}$ 分泌總量的下降幅度，從而發(fā)掘高效的 BACE1 阻斷劑或抑制 APP 異常剪切的靶向藥。

2. $A\beta$ 誘導(dǎo)的內(nèi)源性神經(jīng)毒性、線粒體損傷與自噬障礙機(jī)制解構(gòu)：

   用以探究阿茲海默癥病理發(fā)展中，內(nèi)源性 $A\beta$ 的過(guò)量積聚如何反饋損傷神經(jīng)細(xì)胞自身的生理穩(wěn)態(tài)。它是研究 tau 蛋白異常磷酸化、線粒體自噬（Mitophagy）受損、ROS 活性氧暴發(fā)以及突觸相關(guān)蛋白丟失的絕佳病理動(dòng)力學(xué)模型。

3. 神經(jīng)保護(hù)性藥物（Neuroprotective agents）的療效評(píng)估：

   用于系統(tǒng)性篩選能夠提高神經(jīng)元抗氧化應(yīng)激能力、清除胞內(nèi)異常蛋白聚集物、激活神經(jīng)自噬流（Autophagic flux）以恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞活力的生物活性分子或中藥提取單體。

三 實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞復(fù)蘇、多能性維持培養(yǎng)、常規(guī)傳代與抗生素選擇壓力標(biāo)準(zhǔn)步驟

極其重要的操作警告：為了長(zhǎng)期防止人源突變型 APP695 表達(dá)載體在擴(kuò)增傳代中發(fā)生自發(fā)性丟失、變異或啟動(dòng)子沉默，在其完全培養(yǎng)基中必須維持添加特定劑量的選擇性抗生素。根據(jù)克隆構(gòu)建時(shí)的抗性標(biāo)記，絕大多數(shù) N2a/APP695swe 采用 G418（Geneticin，通常為 200 - 400 $\mu$g/mL）或 Hygromycin B（吸濕霉素 B，通常為 100 - 200 $\mu$g/mL）進(jìn)行維持。

1. 專用培養(yǎng)基、篩選壓力配置與環(huán)境參數(shù)

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：高級(jí)高糖 DMEM（含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺）或 DMEM/F12（1:1） 混合培養(yǎng)基。

• 完全培養(yǎng)基典型配方：

  • 高糖 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

  • 加 10% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS，注意：請(qǐng)勿對(duì)血清進(jìn)行加熱滅活，以保持全系生長(zhǎng)因子的最優(yōu)活性）

  • 加 1% 青霉素-滅菌斯特羅霉素（雙抗）。

  • 基因維持選擇壓力抗生素（核心添加物）：依據(jù)具體質(zhì)控批次，添加標(biāo)定工作濃度的 G418（如 300 $\mu$g/mL）或 Hygromycin B。

    • 特殊細(xì)節(jié)：在凍存管剛復(fù)蘇后的第一代（前 24-48h），為了降低復(fù)蘇物理應(yīng)激、讓脆弱的細(xì)胞最大化貼壁恢復(fù)，完全培養(yǎng)基中切勿添加 G418 或 Hygromycin B；待復(fù)蘇 24 小時(shí)細(xì)胞完全貼壁并進(jìn)入正常對(duì)數(shù)分裂期時(shí)，再更換為含有選擇性抗生素的完全培養(yǎng)基。

• 物理生長(zhǎng)環(huán)境：標(biāo)準(zhǔn) 37 攝氏度，恒溫、飽和高濕度，含 5% 二氧化碳（$CO_2$） 的無(wú)菌孵箱。

2. 冷凍細(xì)胞的復(fù)蘇與柔和接種步序

1. 提前在生物安全柜中準(zhǔn)備好干凈的 T25 培養(yǎng)瓶，注入 5 mL 預(yù)熱至 37 ℃ 的不含維持抗生素的完全培養(yǎng)基。

2. 從液氮罐中取出 N2a/APP695swe 凍存管，迅速全量浸入 37 ℃ 恒溫水浴箱中，快速用力晃動(dòng)，確保在 1 - 2 分鐘內(nèi)令管內(nèi)冰塊完全融化。管帽需保持在水面以上以防交叉污染。

3. 用 75% 酒精噴灑凍存管外壁消毒，移入生物安全柜。

4. 用移液槍將重懸液緩慢滴加至盛有 5 mL 預(yù)熱完全培養(yǎng)基的 15 mL 離心管中，輕柔混勻以稀釋 DMSO 濃度。

5. 以 1000 rpm（約 125 g - 200 g）進(jìn)行溫和低速離心 5 分鐘。

6. 小心吸走上清液，切勿擾動(dòng)底部脆弱的細(xì)胞泥沉淀。

7. 加入 1 - 2 mL 新鮮完全培養(yǎng)基（不含抗生素），用移液槍極其輕柔地吹打 3 - 5 次使細(xì)胞重懸。

8. 將懸液全量接種至準(zhǔn)備好的 T25 瓶中，十字交叉搖勻，置于 37 ℃ 孵箱中培養(yǎng)。

9. 復(fù)蘇 24 小時(shí)后，必須進(jìn)行全量換液。此時(shí)吸除含有碎屑的舊培養(yǎng)基，更換為含有標(biāo)準(zhǔn)劑量選擇性抗生素（如 G418）的完全培養(yǎng)基，正式開(kāi)啟 APP 基因的防丟失壓力鎖。

3. 日常貼壁常規(guī)傳代操作（酶學(xué)解離法）

• 傳代時(shí)機(jī)：當(dāng) N2a/APP695swe 細(xì)胞在瓶底密集成片，匯合度（Confluency）達(dá)到 80% 左右 時(shí)必須傳代。該細(xì)胞增殖速度較快（倍增時(shí)間約 24h），且具有明顯的貼壁依賴和輕微的聚集成團(tuán)生長(zhǎng)特性。如果匯合度超過(guò) 90%，細(xì)胞極易自發(fā)從瓶壁成片脫落老化，導(dǎo)致分化和分泌能力大幅退化。

• 操作流程：

  1. 吸除舊培養(yǎng)基，用無(wú)鈣鎂離子的無(wú)菌 PBS 緩沖液輕輕漂洗細(xì)胞層 1 次，徹底洗去殘余血清。

  2. 加入適量 0.25% Trypsin-EDTA 消化液（T25 瓶加入 1 mL，T75 瓶加入 2 - 3 mL）覆蓋整個(gè)細(xì)胞層。

  3. 鏡下動(dòng)態(tài)觀察：置于 37 ℃ 孵箱中消化。該細(xì)胞對(duì)胰酶較為敏感，通常消化 1 - 3 分鐘 即可。在顯微鏡下觀察，一旦發(fā)現(xiàn)多角形細(xì)胞回縮變圓、輕敲培養(yǎng)瓶一側(cè)時(shí)細(xì)胞整片出現(xiàn)松動(dòng)和滑落，必須立刻加入 2 倍體積的含血清完全培養(yǎng)基終止消化。

  4. 用移液槍輕柔吹打瓶壁 3 - 4 次，將其調(diào)理成均勻的單細(xì)胞懸液，避免殘留頑固細(xì)胞團(tuán)塊。

  5. 1000 rpm 離心 5 分鐘，吸除胰酶上清。

  6. 用含有選擇性抗生素的新鮮完全培養(yǎng)基重懸沉淀，按照 1:4 至 1:6 的常規(guī)傳代比例接種至新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足完全培養(yǎng)基，放回孵箱。

4. 疾病模型穩(wěn)定性與質(zhì)控紅線（AD Model Maintenance）

1. 代數(shù)限制（Passage Limit）：由于外源瑞典突變型 APP695 基因在傳代至中晚期時(shí)極易發(fā)生表觀遺傳學(xué)沉默或拷貝數(shù)減少，用于 $A\beta$ 分泌、藥物篩選和機(jī)制研究的細(xì)胞代數(shù)必須嚴(yán)格限制在復(fù)蘇后的 15 - 20 代以內(nèi)。嚴(yán)禁無(wú)限期連續(xù)傳代。實(shí)驗(yàn)室必須建立“早期代數(shù)凍存種子庫(kù)”。

2. 病理分泌質(zhì)檢紅線：在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前，建議挑取培養(yǎng) 48 小時(shí)的上清液進(jìn)行 $A\beta$ ELISA 質(zhì)檢。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)基上清中 $A\beta_{1-40}$ 的穩(wěn)定分泌量應(yīng)維持在高 pg/mg 蛋白級(jí)別（通常 $\gt 500\text{ pg/mg protein}$ 表現(xiàn)），且野生型 $A\beta_{1-42}$ 有明顯可測(cè)出的動(dòng)力學(xué)強(qiáng)豐度。若檢測(cè)發(fā)現(xiàn) $A\beta$ 分泌量斷崖式下跌或無(wú)法檢出，說(shuō)明該批次細(xì)胞已喪失模型多能性，必須立刻予以徹底淘汰，重新復(fù)蘇早期代數(shù)細(xì)胞。

5. 細(xì)胞長(zhǎng)期保存標(biāo)準(zhǔn)

• 凍存液配方：建議使用高血清比例的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)級(jí)配方：60% 基礎(chǔ) DMEM 培養(yǎng)基 + 30% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）+ 10% 二甲基亞砜（DMSO）。注：冷凍液中切勿添加 G418 或任何選擇性抗生素。

• 梯度冷凍規(guī)范：

  1. 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)旺盛期（匯合度約 75% - 80%）、細(xì)胞形態(tài)飽滿規(guī)整的 N2a/APP695swe 細(xì)胞，離心收集沉淀。

  2. 用配制好的冷凍液懸浮，調(diào)整細(xì)胞終密度至 每毫升 1,500,000 - 3,000,000 個(gè)活細(xì)胞。

  3. 分裝入無(wú)菌專用凍存管，立刻移入標(biāo)準(zhǔn)程序降溫盒（Mr. Frosty）。

  4. 將降溫盒投入 -80 ℃ 超低溫冰箱中梯度慢速降溫過(guò)夜（確保滿足 $-1\text{ }^\circ\text{C/min}$ 的溫控梯度）。

  5. 在 24 小時(shí)內(nèi)，迅速將凍存管轉(zhuǎn)移并鎖死在液氮罐（-196 ℃）的液相或氣相中長(zhǎng)期封存。嚴(yán)禁在 -80 ℃ 冰箱中長(zhǎng)期放置，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇存活率嚴(yán)重下滑，或引發(fā) APP 突變基因型的表型退化。

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