BioVector? cES1 (CVCL_JK97) Canine Embryonic Stem Cell Line / cES1 (CVCL_JK97) 犬胚胎干細胞株

一 產(chǎn)品基本信息與細胞生物學(xué)背景

• 細胞名稱：cES1。

• Cellosaurus 檢索號：CVCL_JK97。

• 物種與品種來源：犬（Canis lupus familiaris），更精確地源自經(jīng)典的實驗?zāi)Ｊ饺N——比格犬（Beagle）。

• 發(fā)育階段與組織源起：源自犬類的囊胚期（Blastocyst stage）的內(nèi)細胞群（Inner Cell Mass, ICM）。

• 細胞系建立背景（犬類再生醫(yī)學(xué)的重要底盤）：

  cES1 細胞系是由 Hatoya（鳩谷雄等）及 Inaba（稻葉俊夫）等著名的日本動物繁殖學(xué)與獸醫(yī)再生醫(yī)學(xué)研究團隊于 2006 年成功分離并鑒定的犬胚胎干細胞（Canine Embryonic Stem Cells, cESCs）。

  由于犬類在解剖學(xué)、生理學(xué)、免疫系統(tǒng)構(gòu)造以及自發(fā)性腫瘤和遺傳病譜系上與人類表現(xiàn)出極高的相似性，它們一直被視為評估人類干細胞臨床應(yīng)用安全性與有效性最關(guān)鍵的非中胚層大動物模型。cES1 細胞株的成功建立，攻克了犬類早期胚胎體外消化、內(nèi)細胞群（ICM）機械免疫剝離以及體外維持干細胞多能性（Pluripotency）不分化的核心瓶頸，成為全球研究犬類組織器官再生、伴侶動物現(xiàn)代獸醫(yī)診斷以及基礎(chǔ)哺乳動物早期發(fā)育生物學(xué)的經(jīng)典細胞株。

• 核心表型與細胞生物學(xué)特征：

  • 形態(tài)學(xué)表現(xiàn)：依賴飼養(yǎng)層（Feeder cells，如小鼠胚胎成纖維細胞 MEF）或特定的多能性維持基質(zhì)貼壁生長。在顯微鏡下，cES1 細胞表現(xiàn)為極其典型的、高度密集的克隆樣扁平鳥巢狀生長（Colony formation）?？寺F邊緣極其清晰、平滑，單個細胞體積微小、胞核巨大且核仁清晰，呈現(xiàn)高核質(zhì)比（High nuclear-to-cytoplasmic ratio）。

  • 全能性生化標志（Pluripotency Markers）：經(jīng)分子生物學(xué)驗證，cES1 細胞能持續(xù)呈高度陽性表達經(jīng)典的胚胎干細胞核心轉(zhuǎn)錄因子：Oct4（Pou5f1）、Nanog、Sox2，并且堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）染色呈現(xiàn)極強的特異性深藍紫色陽性。它還表達特定階段胚胎抗原（如 SSEA-3、SSEA-4）以及高分子量糖蛋白（TRA-1-60、TRA-1-81）。

• 生物安全級別：1級（BSL-1）。

二 核心科研價值與獸醫(yī)再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用

cES1 細胞株在伴侶動物高端醫(yī)療、遺傳病模擬和藥理學(xué)評估中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用：

1. 犬類三胚層體外定向分化與器官類器官（Organoids）構(gòu)建：

   cES1 具有完美的體外多能分化潛能。在改變培養(yǎng)基細胞因子配方（如撤去多能性維持因子或進行懸浮擬胚體 EB 培養(yǎng)）后，該細胞能夠自發(fā)或定向分化為內(nèi)胚層（如肝樣細胞）、中胚層（如心肌細胞、成骨細胞）和外胚層（如神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞）。這是構(gòu)建犬類各種靶向類器官模型、用于修復(fù)寵物臨床上諸如犬脊髓損傷、嚴重心肌缺血或糖尿病造成的胰島損傷的底層細胞工廠。

2. 伴侶動物全基因組多能性調(diào)控與表觀遺傳學(xué)解析：

   用于解構(gòu)犬類在早期胚胎發(fā)育階段，染色質(zhì)重塑（Chromatin remodeling）、DNA甲基化修飾以及 X 染色體失活（X-chromosome inactivation）的獨特表觀遺傳時空動態(tài)。這對于提高克隆犬（Somatic cell nuclear transfer, SNT）的存活率與質(zhì)量至關(guān)重要。

3. 獸醫(yī)臨床創(chuàng)新藥物安全性與小分子毒理高通量體外篩查：

   在開發(fā)寵物犬專用新型小分子靶向藥物、抗生素、癌癥化療藥和各種寵物疫苗時，直接在體外利用 cES1 分化的多功能細胞株代替活體比格犬進行高通量的急性細胞毒性（Cytotoxicity）、遺傳毒性和潛在致畸性（Teratogenicity）評估，完美踐行國際實驗動物的 3R 原則（減少、替代、優(yōu)化）。

三 實驗室干細胞復(fù)蘇、多能性維持培養(yǎng)、機械/酶學(xué)傳代標準步驟

極其重要的操作警告：犬類胚胎干細胞（cES1）具有極高的自發(fā)分化（Spontaneous differentiation）傾向。日常維護的關(guān)鍵是嚴密監(jiān)控顯微鏡下的克隆邊緣、維持足量的維持因子（如 LIF）和優(yōu)質(zhì)的基質(zhì)/飼養(yǎng)層，日常操作必須極其輕柔，嚴禁將克隆團徹底吹打成孤立的單個細胞，否則會導(dǎo)致細胞災(zāi)難性的分化或凋亡！

1. 專用培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層基質(zhì)與環(huán)境參數(shù)

• 飼養(yǎng)層依賴或無飼養(yǎng)層基質(zhì)準備：

  • 飼養(yǎng)層體系（推薦經(jīng)典法）：提前一天在 T25 培養(yǎng)瓶中鋪好經(jīng)絲裂霉素 C（Mitomycin C）或射線滅活的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）作為飼養(yǎng)層，待其貼壁匯合形成致密致密的滋養(yǎng)單層。

  • 無飼養(yǎng)層體系：必須使用高級細胞外基質(zhì)（如高級可溶性基底膜基質(zhì) Matrigel 或人源重組多粘連蛋白 Vitronectin）提前包被培養(yǎng)器皿。

• 完全胚胎干細胞培養(yǎng)基（cESC Complete Medium）典型配方：

  • KnockOut DMEM（高級低滲透壓主干培養(yǎng)基）或 DMEM/F12 基底

  • 加 15% - 20% 優(yōu)質(zhì)干細胞專用胎牛血清（ESC-qualified FBS） 或 15% KnockOut Serum Replacement (KSR，外源血清替代物)

  • 加 1% 必需氨基酸（NEAA）

  • 加 1% L-谷氨酰胺（或 GlutaMAX）

  • 加 0.1 mM $\beta$- mercaptoethanol（$\beta$-巰基乙醇，核心抗氧化與維持多能性因子）

  • 加 10 - 20 ng/mL 人源/犬源重組白血病抑制因子（Recombinant LIF）（部分亞型研究可能需要額外添加堿性成纖維細胞生長因子 bFGF 20 ng/mL，依具體傳代特性微調(diào)，主要由 LIF 維持其原始態(tài)多能性）

  • 加 1% 青霉素-鏈霉素雙抗。

• 生長物理常數(shù)：37 攝氏度，含 5% 二氧化碳（$CO_2$） 的恒溫高濕度飽和孵箱。

2. 冷凍干細胞的復(fù)蘇與點陣式接種

1. 提前確認準備好長有滅活 MEF 飼養(yǎng)層、含有 4 mL 預(yù)熱完全 cESC 培養(yǎng)基的 T25 培養(yǎng)瓶。

2. 從液氮罐中取出 cES1 凍存管，立刻全量浸入 37 ℃ 恒溫水浴箱中快速、劇烈搖晃解凍，在 1 分鐘左右令其迅速融化。

3. 噴灑 75% 酒精消毒外壁，移入生物安全柜。

4. 用移液槍將細胞懸液極其緩慢（按滴）加入到盛有 5 mL 預(yù)熱完全培養(yǎng)基的 15 mL 離心管中（干細胞對滲透壓劇變極其敏感，滴加動作必須維持 1-2 分鐘緩慢進行）。

5. 以 800 - 1000 rpm（約 150 - 200 g）溫和離心 5 分鐘，最大化減少對干細胞膜的剪切力。

6. 極其小心地抽干含有 DMSO 的上清液。加入 1-2 mL 新鮮 cESC 完全培養(yǎng)基。

7. 關(guān)鍵手法：使用 P1000 移液槍輕輕吸起并吐出 2 - 3 次即可。千萬不要將細胞沉淀徹底吹成單細胞單懸液！ 必須保留數(shù)個細胞聚集成的小型微細胞團（Cell clumps）。

8. 將帶有微型細胞團的懸液均勻接種到長有 MEF 的培養(yǎng)瓶中，輕柔十字搖勻，放入 37 ℃、5% $CO_2$ 孵箱中。

9. 24 小時后必須全量更換新鮮培養(yǎng)基，洗去死細胞和殘余物質(zhì)，繼續(xù)靜置暗培養(yǎng)。

3. 日常貼壁常規(guī)克隆群傳代操作（機械片段化與溫和酶解）

• 傳代時機：當扁平的“鳥巢狀”大克隆團融合匯合、克隆內(nèi)部開始變得過厚、或者克隆團之間開始相互接觸，且克隆中心尚未發(fā)生自發(fā)分化變黑（匯合度約占視野的 70% - 80% 時，通常 4 - 6 天）必須立刻傳代。

• 操作流程（推薦溫和酶解片段化法）：

  1. 吸除舊培養(yǎng)基，使用無菌的無鈣鎂離子 PBS 緩沖液輕輕漂洗細胞表面 1-2 次。

  2. 加入適量極為溫和的干細胞解離酶（如 StemPro Accutase、或者 1× 膠原酶 IV Collagenase IV，盡量避免使用高強度的普通大腸桿菌來源 Trypsin-EDTA）。

  3. 置于 37 ℃ 孵箱中溫和孵育 2 - 5 分鐘。密切在顯微鏡下動態(tài)觀察。

  4. 終止指征：當觀察到扁平克隆團的邊緣開始出現(xiàn)向內(nèi)收縮、變圓，但整個克隆團還沒有完全碎裂脫落成單細胞時，立刻加入 2 倍體積的含血清完全培養(yǎng)基終止消化。

  5. 用移液管輕柔地沖洗瓶壁，將開始松動的克隆團洗脫下來，收集至離心管。

  6. 控制吹打力度：輕柔吹打 2 - 3 次，將其剪切成包含幾十個到上百個細胞的微小片段（Small clumps of 50-100 cells）。

  7. 1000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸這些克隆片段。

  8. 按照 1 比 3 至 1 比 4 的常規(guī)稀釋比例接種至鋪有全新 MEF 飼養(yǎng)層的培養(yǎng)器皿中，旋松瓶蓋，37 ℃ 穩(wěn)定靜置培養(yǎng)，傳代后 48 小時內(nèi)盡量避免反復(fù)翻動和震動搖晃搖擺，以便細胞片段完美錨定貼壁。

4. 顯微鏡下多能性狀態(tài)與自發(fā)分化（質(zhì)量核心控制點）

• 完美的未分化狀態(tài)（標桿未分化）：

  cES1 克隆群邊緣銳利光滑，呈致密的二維/微三維扁平“海島狀”或“鳥巢狀”。克隆內(nèi)部細胞排列高度致密，看不出單個細胞的獨特邊界，折光度在顯微鏡下非常均一。

• 分化狀態(tài)提示（必須淘汰或手工刮除的劣質(zhì)狀態(tài)）：

  如果培養(yǎng)基內(nèi)的 LIF 濃度失效、或者消化過度吹成了單個細胞，克隆團邊緣將開始泛黃、變得粗糙不規(guī)則，細胞從邊緣散落逸出，呈現(xiàn)出拉長的成纖維細胞樣、或者完全鋪開的上皮細胞樣（Flattened epithelial-like）形態(tài)?？寺≈行囊部赡苈∑鹱兒冢珹P 染色轉(zhuǎn)陰。一旦出現(xiàn)這種情況，需要在傳代前，在顯微鏡下用無菌巴氏吸管尖端或?qū)Ｓ酶杉毎蔚叮瑢⒆儺惙只膮^(qū)域手工機械刮除并吸走（Mechanical picking out），只保留最純凈的圓形未分化克隆進行傳代，以確保該干細胞庫純正的宿主多能性。

5. 細胞長期保存標準

• 冷凍保存液配方：90% 優(yōu)質(zhì)胚胎干細胞完全培養(yǎng)基 加 10% 分析級二甲基亞砜（DMSO）；或者采用更高級的干細胞無血清高存活凍存液（如 CryoStor CS10）。

• 梯度冷凍規(guī)范：

  1. 收集處于生長最旺盛的中期、未分化率 $\gt 95\%$ 的 cES1 克隆群片段（維持微小細胞團狀態(tài)，嚴禁將其打成單細胞）。

  2. 溫和離心沉淀后，用預(yù)冷的凍存液重懸，迅速分裝入專用凍存管。

  3. 立即裝入標準程序降溫盒中，投入 -80 ℃ 冰箱中緩慢梯度降溫過夜。

  4. 24 小時內(nèi)，極其迅速地將凍存管轉(zhuǎn)移入液氮罐（-196 ℃）中鎖死長期存放。胚胎干細胞對溫度波動極其敏感，在液氮中才能確保其多能性標志物與犬類染色體組的長期遺傳穩(wěn)定。

BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌株細胞蛋白抗體基因保藏中心

電話:400-800-2947

工作QQ/微信同號:1843439339

網(wǎng)址http://www.nedfriskphoto.com