BioVector? pDONR222 入門克隆載體 / BioVector? pDONR222 Gateway? Donor Vector

通用定義 / General Definition:BioVector? pDONR222 是基于 Gateway? 重組克隆技術(shù) 的核心入門載體（Donor Vector）。它主要用于通過 BP 反應(yīng) 接收含有 attB 位點(diǎn)的 PCR 產(chǎn)物或 DNA 片段，從而構(gòu)建入門克?。‥ntry Clone）。pDONR222 是 pDONR221 的優(yōu)化版本，其主要區(qū)別在于骨架序列的調(diào)整，旨在提高測(cè)序引物的通用性和某些宿主菌中的克隆穩(wěn)定性。它是將目的基因轉(zhuǎn)移至各類表達(dá)載體（Destination Vectors）的中轉(zhuǎn)站。

BioVector? pDONR222 is a primary donor vector for the Gateway? Recombination Cloning Technology. It is designed to capture DNA fragments or PCR products flanked by attB sites via a BP reaction, resulting in an Entry Clone. pDONR222 is a functional variant of pDONR221, featuring minor backbone sequence optimizations to enhance sequencing primer compatibility and cloning stability in specific hosts. It serves as the essential intermediate for shuttling genes of interest into various Destination Vectors.

BioVector? pDONR222 技術(shù)參數(shù) (Technical Specifications)

1. 載體核心元件

• 重組位點(diǎn)：attP1 和 attP2。它們與含有 attB1/B2 的片段反應(yīng)，生成 attL1/L2 入門克隆。

• 負(fù)篩選標(biāo)記：ccdB 基因。位于兩個(gè) attP 位點(diǎn)之間。只有成功發(fā)生重組（替換掉 ccdB）的克隆才能在常規(guī)大腸桿菌（如 DH5α）中存活。

• 抗性標(biāo)記：Kanamycin (卡那霉素 / KanR)。

• 復(fù)制子： pUC origin (高拷貝)。

• 測(cè)序引物： 兼容 M13 Forward 和 M13 Reverse 引物，方便對(duì)插入片段進(jìn)行雙向測(cè)序驗(yàn)證。

2. Gateway 反應(yīng)原理

• BP 反應(yīng)：$attB(insert)+attP(pDONR222)\to attL(EntryClone)+attR(Byproduct)$。

• LR 反應(yīng)：$attL(EntryClone)+attR(DestinationVector)\to attB(ExpressionClone)+attP(Byproduct)$。

主要科研應(yīng)用 (Research Applications)

1. 高通量克隆構(gòu)建

• 基因庫(kù)建立： 將大量 ORF（開放閱讀框）批量導(dǎo)入 pDONR222，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的入門克隆庫(kù)。

2. 跨平臺(tái)基因表達(dá)

• 一轉(zhuǎn)多： 一旦基因進(jìn)入 pDONR222，無(wú)需再次通過限制性內(nèi)切酶克隆，即可通過簡(jiǎn)單的 LR 反應(yīng)將其轉(zhuǎn)移至原核、真核、病毒或植物表達(dá)載體中。

3. 序列驗(yàn)證

• 標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)站： pDONR222 的骨架設(shè)計(jì)非常適合對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行初期捕獲和 Sanger 測(cè)序確認(rèn)。

實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) (Experimental Guidelines)

• 宿主菌選擇：

  • 構(gòu)建入門克隆： 必須使用常規(guī)菌株（如 DH5α, TOP10），此時(shí) ccdB 基因被移除，只有重組成功的克隆生長(zhǎng)。

  • 擴(kuò)增空載體： 必須使用 ccdB 生存菌株（如 DB3.1 或 ccdB Survival 2 T1R），否則質(zhì)粒無(wú)法復(fù)制。

• PCR 產(chǎn)物要求： 引物末端需帶有標(biāo)準(zhǔn)的 attB1 ($5^{\prime }?GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT...$) 和 attB2 ($5^{\prime }?GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT...$) 序列。

• 質(zhì)粒純度： BP 反應(yīng)對(duì) DNA 純度敏感，建議 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收以去除引物二聚體和雜帶。

技術(shù)指標(biāo) (Technical Data Summary)

注意 / Note: pDONR222 和 pDONR221 在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中可以互換，但 pDONR222 的序列在 attP 區(qū)域附近進(jìn)行了微調(diào)，通常認(rèn)為它在大型片段克隆中的穩(wěn)定性略好。pDONR222 and pDONR221 are largely interchangeable; however, pDONR222 features minor sequence adjustments around the attP regions, often providing slightly better stability for larger inserts.

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