BioVector? pCM184 廣宿主范圍重組載體 / BioVector? pCM184 Broad-Host-Range Recombination Vector

通用定義 / General Definition:

BioVector? pCM184 是一種專為革蘭氏陰性菌（特別是甲基營養(yǎng)菌 Methylobacterium 屬及其他 Alphaproteobacteria）設(shè)計的廣宿主范圍自殺型質(zhì)粒載體，常用于等位基因交換（Allelic Exchange）以實現(xiàn)基因敲除或點突變。該質(zhì)粒基于 pBBR1 復(fù)制子，但其核心功能是作為一種高效的基因替代工具。它攜帶了 Cre-lox 系統(tǒng)，允許在重組完成后移除篩選標(biāo)記，從而實現(xiàn)無痕編輯或在同一菌株中進行多重基因操作。

BioVector? pCM184 is a broad-host-range "suicide" vector designed primarily for Gram-negative bacteria, such as Methylobacterium species and other Alphaproteobacteria. It is a powerful tool for allelic exchange, enabling precise gene knockouts or site-directed mutagenesis. While based on the pBBR1 origin, its primary utility lies in gene replacement. It incorporates the Cre-lox system, allowing for the excision of the selectable marker after recombination, which facilitates markerless editing and sequential genetic manipulations in a single strain.

BioVector? pCM184 技術(shù)參數(shù) (Technical Specifications)

1. 載體核心元件

• 復(fù)制子： pBBR1-derived (在某些非宿主中表現(xiàn)為不穩(wěn)定性，有助于通過抗性壓力篩選雙交換重組子)。

• 篩選標(biāo)記：

  • Kanamycin (KanR)： 位于兩個 loxP 位點之間。

• 反向篩選標(biāo)記： 通常包含 sacB 基因（枯草芽孢桿菌來源），用于在含蔗糖培養(yǎng)基上進行負篩選，篩選第二次交叉重組成功的克隆。

• 多克隆位點 (MCS)： 側(cè)翼含有方便插入同源臂的限制性酶切位點。

• 轉(zhuǎn)移功能： 含有 mob 基因，可通過接合轉(zhuǎn)移（Conjugation）從供體菌（如 E. coli S17-1）進入靶細菌。

2. 工作流程 (Workflow)

1. 構(gòu)建： 將目標(biāo)基因的上下游同源臂克隆至 pCM184。

2. 接合： 通過接合將質(zhì)粒導(dǎo)入靶細胞。

3. 初篩： 通過卡那霉素篩選單交換重組子（質(zhì)粒整合進染色體）。

4. 復(fù)篩： 利用蔗糖壓力篩選雙交換重組子（質(zhì)粒骨架丟失，僅留下被插入片段）。

5. 標(biāo)記移除： 引入表達 Cre 酶的質(zhì)粒（如 pCM157），切除位于 loxP 之間的卡那霉素抗性基因。

主要科研應(yīng)用 (Research Applications)

1. 甲基營養(yǎng)菌遺傳工程

• 代謝通路改造： 敲除競爭性通路基因，提高碳 1 代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。

2. 無痕基因編輯

• 多重敲除： 利用 Cre-lox 系統(tǒng)回收抗性標(biāo)記，允許在同一個背景菌株中連續(xù)敲除多個目標(biāo)基因。

3. 功能基因組學(xué)

• 必需基因驗證： 構(gòu)建條件致死突變株或基因替代株以確定基因功能。

實驗操作注意事項 (Experimental Guidelines)

• 反向篩選靈敏度： 并非所有細菌對 sacB 介導(dǎo)的蔗糖毒性都敏感。在開始敲除實驗前，建議先測試背景菌株對 5% 到 10% 蔗糖的敏感性。

• 同源臂長度： 為了獲得較高的重組效率，建議同源臂長度在 500 bp 到 1000 bp 之間。

• 接合效率： 接合轉(zhuǎn)移受供體/受體比例和接合時間的影響較大，通常建議比例為 1:1 或 1:3。

技術(shù)指標(biāo) (Technical Data Summary)

注意 / Note: pCM184 及其系列載體（如 pCM185 等）是甲基營養(yǎng)菌研究領(lǐng)域的經(jīng)典工具。由于其分子量適中且功能模塊化，它比傳統(tǒng)的基于 pRK290 的載體更易于操作。

pCM184 and its sister vectors (e.g., pCM185) are quintessential tools in methylotroph genetics. Their moderate size and modular functional components make them significantly easier to manipulate than traditional pRK290-based systems.

BioVector NTCC質(zhì)粒載體菌株細胞蛋白抗體基因保藏中心

電話:400-800-2947

工作QQ/微信同號:1843439339

網(wǎng)址

http://www.nedfriskphoto.com