BioVector? pNZ8048-Gam-Exo-Beta 乳酸菌重組工程質(zhì)粒 / BioVector? pNZ8048-Gam-Exo-Beta Lactic Acid Bacteria Recombineering Plasmid

通用定義 / General Definition:BioVector? pNZ8048-Gam-Exo-Beta 是一種專門用于乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis) 及相關(guān)乳酸菌（LAB）基因組編輯的誘導(dǎo)型重組載體。該質(zhì)粒基于經(jīng)典的 NICE (Nisin Controlled Gene Expression) 系統(tǒng)，通過 PnisA 啟動子 受乳酸鏈球菌素（Nisin）的嚴(yán)格調(diào)控。載體集成了源自 λ 噬菌體的 Red 重組系統(tǒng) 三組分：Gam（保護外源 DNA 不被核酸酶降解）、Exo（5'-3' 外切酶，產(chǎn)生單鏈末端）和 Beta（單鏈退火蛋白）。該質(zhì)粒是乳酸菌進行高效、精確染色體修飾（如基因敲除、插入或點突變）的核心分子工具。

BioVector? pNZ8048-Gam-Exo-Beta is an inducible recombineering vector specifically designed for genome editing in Lactococcus lactis and other Lactic Acid Bacteria (LAB). Based on the classic NICE (Nisin Controlled Gene Expression) system, the expression of the integrated genes is strictly controlled by the PnisA promoter upon induction with Nisin. The plasmid carries the λ phage Red recombinase system components: Gam (protects exogenous DNA from nuclease degradation), Exo (a 5'-3' exonuclease that generates single-stranded overhangs), and Beta (a single-strand annealing protein). It is the essential molecular tool for high-efficiency, precise chromosomal modifications, such as gene knockouts, insertions, or point mutations in LAB.

BioVector? pNZ8048-Gam-Exo-Beta 技術(shù)參數(shù) (Technical Specifications)

1. 載體元件構(gòu)成

• 骨架載體： pNZ8048（乳酸菌廣宿主范圍復(fù)制子）。

• 啟動子： PnisA (Nisin 誘導(dǎo)啟動子)。

• 重組基因盒： Gam-Exo-Beta（λ-Red 同源重組系統(tǒng)）。

• 篩選標(biāo)記：Chloramphenicol (氯霉素 / CmR)，適用于大腸桿菌和乳酸菌篩選。

• 宿主范圍： 主要是 L. lactis (如 NZ9000 菌株，需含有 nisR/K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng))，亦可拓展至部分 Lactobacillus 屬。

2. 工作機制

1. 誘導(dǎo)表達： 在加入微量 Nisin 后，PnisA 啟動子開啟，表達 Gam、Exo 和 Beta 蛋白。

2. 重組準(zhǔn)備： 此時電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入線性雙鏈 DNA（dsDNA）或單鏈寡核苷酸（ssDNA）。

3. 同源重組： Beta 蛋白介導(dǎo)外源 DNA 與染色體靶位點的同源重組。

主要科研應(yīng)用 (Research Applications)

1. 基因組精確編輯

• 基因敲除： 快速移除代謝通路中的關(guān)鍵基因（如乳酸脫氫酶基因 ldh），用于代謝工程改造。

• 點突變引入： 通過 ssDNA 重組引入同義突變或功能位點改變。

2. 代謝工程改造

• 底物擴展： 整合異源基因，使乳酸菌能夠利用廉價生物質(zhì)原料。

• 細(xì)胞工廠構(gòu)建： 穩(wěn)定集成高效表達盒至染色體，生產(chǎn)高價值蛋白或次級代謝產(chǎn)物。

實驗操作指南 (Experimental Guidelines)

• 宿主菌要求： 必須使用含有 nisRK 二元調(diào)控系統(tǒng)的宿主（如 L. lactis NZ9000）。

• 誘導(dǎo)條件： 常用誘導(dǎo)濃度為 1-10 ng/mL Nisin。過高濃度會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，抑制重組效率。

• 電轉(zhuǎn)化參數(shù)： 乳酸菌細(xì)胞壁較厚，需制備高能力的感受態(tài)細(xì)胞，并使用高壓電擊參數(shù)（如 2.0-2.5 kV）。

• 重組模板設(shè)計： 兩側(cè)同源臂建議長度為 500-1000 bp (對于 dsDNA) 或 70-100 nt (對于 ssDNA)。

技術(shù)指標(biāo) (Technical Data Summary)

注意 / Note: pNZ8048 系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)物的情況下具有極低的背景表達，這對于維持含有毒性重組蛋白的細(xì)胞穩(wěn)定性至關(guān)重要。重組完成后，通常需要通過無壓力培養(yǎng)或高溫（如果是溫敏載體）將該質(zhì)粒消除。The pNZ8048 system features extremely low basal expression in the absence of an inducer, which is critical for maintaining cell stability when carrying potentially toxic recombinase proteins. After successful recombineering, the plasmid is typically cured through non-selective subculturing.

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