GFP-P4M-SidMx2 BioVector?檢測細胞內(nèi) 4-磷酸磷脂酰肌醇PI4P的哺乳動物表達質(zhì)粒

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貨　　號：BioVector?GFP-P4M-SidMx2
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BioVector?

GFP-P4M-SidMx2（BioVector #51472）是一種專門用于檢測細胞內(nèi) 4-磷酸磷脂酰肌醇 (PI4P) 的哺乳動物表達質(zhì)粒。該質(zhì)粒由 Tamas Balla 實驗室開發(fā)，通過串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)提高了探針的靈敏度。

關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)

質(zhì)粒類型：哺乳動物細胞表達 / 脂質(zhì)傳感器。
插入片段：來自 Legionella pneumophila SidM 蛋白的兩個串聯(lián) P4M 結(jié)構(gòu)域（殘基 546-647）。
熒光基團：EGFP（增強型綠色熒光蛋白），融合在插入片段的 N 端。
啟動子：CMV (強啟動子，用于在哺乳動物細胞中高效表達)。
骨架載體： pEGFP-C1。
載體大?。?/span> 約 5.3 kb。

克隆與篩選信息

細菌抗性：卡那霉素 (Kanamycin)，常用濃度 50 μg/mL。
哺乳動物細胞篩選：G418 (新霉素)。
克隆位點：插入片段通常位于 EcoRI (5′) 和 SalI (3′) 之間。
測序引物：
- 5′ 前向引物： EGFP-C (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3')。
- 3′ 反向引物： SV40-R。

生物學應(yīng)用

該質(zhì)粒主要用于可視化 PI4P 在質(zhì)膜和高爾基體中的分布。與單結(jié)構(gòu)域探針相比，“x2” 串聯(lián)設(shè)計顯著增強了探針與 PI4P 的親和力，使其能夠捕捉到細胞內(nèi)微量的脂質(zhì)池。

GFP-P4M-SidMx2 (BioVector #51472) is a specialized mammalian expression plasmid used as a highly sensitive fluorescent biosensor for detecting Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) in cells. It was developed by Tamas Balla's laboratory at the NIH to overcome the low affinity of single P4M domain probes.

Key Specifications

Plasmid Type: Mammalian Expression / Lipid Sensor
Insert: Two tandem copies of the P4M domain from the Legionella pneumophila SidM protein (residues 546-647).
Fluorophore:EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) fused to the N-terminal of the insert.
Promoter:CMV (strong constitutive promoter for high expression in mammalian cells).
Backbone: pEGFP-C1.
Total Size: Approximately 5.3 kb (Backbone: 4.7 kb + Insert: ~0.6 kb).

Cloning & Selection

Bacterial Resistance: Kanamycin (typically 50 μg/mL).
Mammalian Selection: G418 (Neomycin).
Cloning Sites: The insert is typically located between EcoRI (5′) and SalI (3′) restriction sites.
Sequencing Primers:
- 5′ Forward: EGFP-C (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3').
- 3′ Reverse: SV40-R.

Biological Application

This plasmid is primarily used to visualize PI4P localization at the plasma membrane and Golgi apparatus. The "x2" tandem repeat significantly increases the probe's avidity for PI4P, allowing for the detection of smaller pools of the lipid that single-domain sensors (like P4M-SidM x1) might miss.

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