pBBR1MCS2-Tac-NgAgo

微生物NgAgo新型基因編輯系統(tǒng)載體

描述：

pBBR1MCS2-Tac-NgAgo質(zhì)粒，采用Tac強啟動子，未加操縱子，組成性表達(dá)，預(yù)留了BamHI+HindIII酶切位點，可以根據(jù)自己的需要更換啟動子序列，NgAgo基因使用一種古菌中該基因的天然序列（CP003377.1），該質(zhì)粒主要用于各種微生物的基因編輯操作，已證實可以在許多革蘭氏陰性菌中復(fù)制表達(dá)；

pBBR1MCS-2空載體是由Kovach等構(gòu)建，已經(jīng)證實可以在許多革蘭氏陰性菌中進行復(fù)制，包括Acetobacter xylinum、Alcaligenes eutrophus、Bartonella bacilliformis、百日咳桿菌、布魯氏菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、苜蓿根瘤菌、球形紅假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌和霍亂弧菌等等。

Map圖譜：

關(guān)于NgAgo系統(tǒng)：

替代Cas9的新型基因編輯技術(shù)，Nature最新報道，表達(dá)Natronobacterium gregoryi Argonaute，規(guī)避了CAS9天然的弱點-脫靶效應(yīng)，利用短鏈DNA作向?qū)?，真正實現(xiàn)了對基因組的任意位置進行切割，將基因編輯的可能性推入了更廣泛的境地。

該研究成果找到了對基因組位點編輯范圍更廣的基因編輯工具。該工具完全不同于以RNA為向?qū)У腃RISPR/Cas9基因編輯技術(shù)：這種從古細(xì)菌來源的Argonaute（簡稱NgAgo），利用短鏈DNA作向?qū)В嬲龑崿F(xiàn)了對基因組的任意位置進行切割，將基因編輯的可能性推入了更廣泛的境地。該項技術(shù)具有以下明確優(yōu)勢：
1. 向?qū)гO(shè)計制作簡便：可以像合成PCR引物一樣合成短鏈單鏈DNA向?qū)?；向?qū)Э芍苯愚D(zhuǎn)染細(xì)胞和組織而無需構(gòu)建向?qū)П磉_(dá)載體。2. 可編輯基因組內(nèi)任何位置：Cas9基因組的靶點選擇受到PAM區(qū)和富含GC區(qū)的限制。而NgAgo對靶點選擇沒有限制，對基因組任何位置都能有效引入雙鏈斷裂。3，由于向?qū)Ш怂崾荄NA而非RNA，因此避免了RNA易于形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)而帶來的失效或者脫靶效應(yīng)。4，對游離于細(xì)胞核的DNA具有更高的切割效率。
與Cas9技術(shù)相比，Cas9需要19個配對的堿基，并且要求在需要編輯的基因組上這19個堿基后面必須緊鄰一個符合一定特征的三堿基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設(shè)計，而NgAgo–gDNA系統(tǒng)不需要PAM序列，拓寬了其設(shè)計范圍。因此，從理論上講，Cas9技術(shù)存在極限。


但是，NgAgo結(jié)合24個堿基的gDNA，這比Cas9的gRNA（19個堿基）要長5個堿基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當(dāng)于在一本書中的某個位置找到一個短單詞將它替換成另一個長單詞，這樣就不容易出現(xiàn)誤替換現(xiàn)象。舉個例子，如果替換一篇文章中的the這樣的簡單單詞，很容易把含有the三個字母的單詞誤替換了，如they，但是如果找一個更長的單詞，如pneumonoultramicroscopy，就不容易出現(xiàn)誤替換現(xiàn)象。


不僅如此，NgAgo–gDNA系統(tǒng)對向?qū)蛄?靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個堿基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統(tǒng)比Cas9系統(tǒng)效率更高。NgAgo的gDNA需要5’端磷酸化的單鏈DNA （5p-ssDNA），這種形式的DNA在哺乳動物細(xì)胞中幾乎不存在，這保證了NgAgo不會被內(nèi)源的DNA序列錯誤帶到不該去的地方。該系統(tǒng)的另外一個優(yōu)點是5p-ssDNA是外源轉(zhuǎn)化進細(xì)胞的，其時間和濃度可以非常精確地控制。而Cas9系統(tǒng)的gRNA是內(nèi)源表達(dá)的質(zhì)粒,難以精確地控制。
該技術(shù)可用于微生物、植物和動物的精準(zhǔn)基因改造，以及乙肝、艾滋病或者一些遺傳性疾病的“基因治療”，在人類血液、器官的編輯和再造等方面具有重要意義，在醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)，畜牧等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。

RNA 導(dǎo)向的核酸內(nèi)切酶Cas9使得基因編輯成為了一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)。然而，盡管科學(xué)家們已嘗試多種方式對Cas9系統(tǒng)進行優(yōu)化以提高它的效率和特異性，但該系統(tǒng)的實用性依然受到了一些因素的限制，包括其對導(dǎo)向-靶向（guide–target）錯配的耐受性以及導(dǎo)向RNA相對容易形成二級結(jié)構(gòu)等。

類似于Cas9，來自Argonaute蛋白家族的內(nèi)切酶也可以利用寡核苷酸作為引導(dǎo)，降解侵入性的基因組。Argonautes在基因表達(dá)抑制以及抵御外來核酸方面起著關(guān)鍵的作用。

4月12日，發(fā)表在PNAS上的一項研究中，加州大學(xué)伯克利分校的研究人員揭示了一種Argonaute非典型的導(dǎo)向RNA特異性，論文的通訊作者是CRISPR先驅(qū)之一的Jennifer A. Doudna。

5月2日，最新發(fā)表在Nature Biotechnology上的一項研究中，河北科技大學(xué)以及浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員報告稱，Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）是一種DNA導(dǎo)向的可用于人類細(xì)胞基因編輯的核酸內(nèi)切酶。NgAgo可結(jié)合約24個核苷酸大小的5′磷酸化單鏈導(dǎo)向 DNA（guide DNA ，gDNA），有效形成位點特異的DNA雙鏈缺口。

據(jù)悉，CRISPR/Cas9的靶向特異性 是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個短DNA基序（DNA motif）的結(jié)合，這個短DNA基序通常在靶DNA的3'末端發(fā)現(xiàn)，被稱為前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）[文獻]。

與Cas9不同，NgAgo–gDNA系統(tǒng)不需要PAM，初步鑒定表明，該系統(tǒng)對導(dǎo)向-靶向（guide–target）錯配耐受低，且對編輯富含G+C的基因組更加有效。據(jù)介紹，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes幾乎存在于所有的有機體中。

此外，要想與Cas9正確綁定，導(dǎo)向RNA必須有3′RNA-RNA雜化結(jié)構(gòu)，而與Argonaute綁定不需要導(dǎo)向分子有任何特定的二級結(jié)構(gòu)。另一方面，Cas9只能切割PAM上游的序列，而Argonaute不需要靶標(biāo)有特定的序列。作者們表示，Natronobacterium gregoryi Argonaute有望成為編輯哺乳動物基因組的精準(zhǔn)有效的工具。
該技術(shù)的優(yōu)勢：
　　1. DNA 比RNA更穩(wěn)定，更易操作。操做過RNA的都知道。
　　2. 削減了gRNA并非用于matching的冗余部分，精簡了Primer，取消了PAM的限制，以及5' hairpin stemloop，而且直接用單鏈DNA。這些特質(zhì)都完勝Crispr/Cas9

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