前言

NusA融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)于9年前（1999年）由Davis發(fā)明，并在2000年由Novagen首先進(jìn)行商業(yè)化設(shè)計(jì)和開發(fā)，特別推薦用于以NusA作為N端標(biāo)簽時(shí)提高在大腸桿菌中難溶的重組表達(dá)蛋白的可溶性。NusA融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)面市至今，已經(jīng)通過一些高通量表達(dá)篩選的評估確認(rèn)其在可溶性改善方面的有效性。關(guān)于NusA融合表達(dá)蛋白去除或不去除NusA標(biāo)簽，目的蛋白仍然具有活性的報(bào)道也有很多。正是由于NusA標(biāo)簽系統(tǒng)的這種特性，使其成為目前在大腸桿菌表達(dá)體系中使用最為廣泛的三個(gè)融合標(biāo)簽之一（Cabrita，2006）。NusA提高蛋白可溶性的機(jī)制一直被研究探討，已經(jīng)獲得一些認(rèn)識。本文總結(jié)和回顧這些關(guān)于NusA系統(tǒng)性能的研究報(bào)道。

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各種“難溶蛋白”與NusA標(biāo)簽重組表達(dá)顯著提高可溶性

在眾多NusA標(biāo)簽融合蛋白可溶性研究報(bào)告中，有三篇文章因?yàn)槠溲芯克婕暗牡鞍椎臄?shù)量多和異源性范圍廣而得到研究者的重視。這些研究結(jié)果被總結(jié)在表1中。其中，Shih等（2002）的研究由于包括了來自四個(gè)不同物種的目標(biāo)蛋白而尤為重要。在Korf等（2005）的研究中，他們發(fā)現(xiàn)20℃誘導(dǎo)比30℃誘導(dǎo)的NusA標(biāo)簽蛋白有更好的可溶性。另外，使用NusA系統(tǒng)驗(yàn)證，八個(gè)較大分子量蛋白（>70kDa）中的七個(gè)得到了可溶性表達(dá)，而其它的融合標(biāo)簽（GST，MBP和hexahistidine）系統(tǒng)則只得到了四個(gè)可溶性表達(dá)的蛋白。

表1.用大量的目標(biāo)蛋白評估NusA標(biāo)簽對提高融合蛋白可溶性的作用

a. Korf等和Kohl等的研究中包含了六組氨酸標(biāo)簽。
b. 可溶性蛋白量大于等于10%即認(rèn)為該融合蛋白可溶。
c. 純化后的融合蛋白如果在SDS-PAGE后考染在合適位置出現(xiàn)條帶即認(rèn)為可溶。

Korf等的還發(fā)現(xiàn)對于定位于真核細(xì)胞細(xì)胞器，質(zhì)膜或者骨架的蛋白，相對于其它標(biāo)簽系統(tǒng)來講，NusA標(biāo)簽是最好的可溶性表達(dá)的選擇。Kohl等（2008）也發(fā)現(xiàn)只要在20-25℃誘導(dǎo)表達(dá)，NusA標(biāo)簽?zāi)軌虼蟠筇岣唠y表達(dá)的蛋白比如膜蛋白的可溶性。與Korf等的研究結(jié)果一致，Kohl等也發(fā)現(xiàn)25℃誘導(dǎo)表達(dá)比30℃或37℃誘導(dǎo)表達(dá)可以純化得到更多的NusA融合蛋白。

切除NusA標(biāo)簽獲得后保持活性且正確折疊的蛋白

表2總結(jié)了16個(gè)采用NusA標(biāo)簽成功獲得可溶性蛋白，在切除標(biāo)簽后這些蛋白仍有正確折疊結(jié)構(gòu)和活性。大部分這種研究是是關(guān)于分子量小于或接近20kDa的目標(biāo)蛋白。純化后的目標(biāo)蛋白產(chǎn)量范圍在1.5-100mg/L。趨化因子和細(xì)胞因子可以得到高達(dá)30-100mg/L的產(chǎn)量。其它關(guān)于這些蛋白表達(dá)和純化的有參考價(jià)值信息包括：

■ 植物磷酸烯醇式丙酮酸—羧化酶激酶（Ermolova2003）——目標(biāo)蛋白切除標(biāo)簽后用BDA（藍(lán)色葡聚糖）親和層析樹脂純化。純化后蛋白的催化活性比未切除標(biāo)簽的融合蛋白高50倍。
■ Xklp3a，Tep3Ag和E8R（De Marco2004）——用蛋白酶切割后，His-融合的TEV和NusA被Ni2+離子親和色譜選擇性去除。與Ni2+親和結(jié)合的標(biāo)簽被緊密地結(jié)合在樹脂上，在流出液中則可以得到純化的目的蛋白。所有這三種蛋白在純化后都正確折疊且均一分散在溶液中。純化的膜結(jié)合蛋白E8R牛痘病毒蛋白在Tris緩沖液中除去NusA后出現(xiàn)了沉淀，然而加入0.02%的月桂?；溠刻擒蘸?50mM的氯化鈉后，蛋白又重新變得可溶。
■ 環(huán)麥芽糖糊精酶（Turner2005）——這個(gè)蛋白屬于α-淀粉酶家族。這個(gè)家族的蛋白通常在大腸桿菌中很難以活性形式表達(dá)出來。將其與腸激酶混合孵育24小時(shí)以上會使其活性逐漸增強(qiáng)，直到達(dá)到未經(jīng)腸激酶處理過的融合蛋白的2倍以上，這也說明標(biāo)簽的存在降低了該酶的活性。可以用固化了Cu2+的親和層析柱去除切除的融合標(biāo)簽。
■ 八種人趨化因子（Magis-trelli 2005）——所有的蛋白都在OrigamiTMB菌株中表達(dá)提高它們在胞質(zhì)中的二硫鍵形成率。在趨化因子編碼序列的C端引入了AviTMTag（親和素）生物素化序列。切割后的細(xì)胞趨化因子可以用單體的親和素樹脂親和層析與切割下的NusA標(biāo)簽和蛋白酶混合物分離開。所有切割純化后的蛋白在細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)中都顯示了活性，而沒有一個(gè)融合蛋白有這樣的活性。
■ 蚯蚓血紅蛋白（Karlsen2005）——酶切后，用分子篩分離純化蚯蚓血紅蛋白，純化后的蛋白通過圓二色譜檢測得到的α-螺旋結(jié)構(gòu)與模型預(yù)期結(jié)果一致，且純化后的蛋白可以以單體的形式穩(wěn)定保存。
■ 人白介素-29（Li2006）——用S-蛋白親和層析比Ni2+親和層析可以得到更純的目的蛋白。將融合蛋白N端的NusA/His?Tag?/S?Tag?標(biāo)簽切掉后，用鏈親和素瓊脂去除生物素標(biāo)記的凝血酶。用水皰性口膜炎病毒（VSV）處理固定的人羊膜上皮細(xì)胞（WISH細(xì)胞）后，通過檢測純化的IL-29對細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)來檢測其抗病毒活性。
■ 人干擾素-λ2（Li2007）——酶切后，用Novagen提供的EKaptureTM瓊脂除去重組的腸激酶。先用純化后的干擾素-λ2處理WISH細(xì)胞，24小時(shí)后加入VSV病毒，可以觀察到干擾素-λ2可以有效地保護(hù)細(xì)胞免于病毒介導(dǎo)的病變。

表2.切除NusA標(biāo)簽獲得后保持活性且正確折疊的蛋白

a. 未報(bào)道
b. 根據(jù)NCBI報(bào)道預(yù)測的全長蛋白分子量

與NusA標(biāo)簽融合且具有活性的蛋白

與這些切除NusA標(biāo)簽后保持活性且正確折疊的蛋白不同，還有很多報(bào)道指出目的蛋白在“NusA-目的蛋白”的融合形式時(shí)具有很好的活性。比如單鏈（ScFv）催化活性抗體14D9（Zheng2003），來自Aequorea victoria的綠色熒光蛋白（Nallamsetty2006），人二氫葉酸還原酶（Nallamsetty 2006），來自Ensis directus蟶子的精氨酸酶激酶（Compaan2003），來自B. thuringiensis的修飾δ-內(nèi)毒素（Kumar 2005），人BCMA跨膜受體（Guan2006），植物α-雙加氧酶1（Liu 2006），以及來自Plasmodiumfalciparum的b-ketoacyl-acyl載體蛋白合成酶（Lack2006）等，反映了各種不同背景的蛋白都顯示出了與NusA標(biāo)簽融合后的活性。

NusA標(biāo)簽提高蛋白可溶性的可能機(jī)制

Houry（1999）等揭示NusA蛋白是分子伴侶GroEL在體內(nèi)的必須底物。而GroEL與其共作用因子GroES是大腸桿菌唯一的在所有生長條件下必需的分子伴侶系統(tǒng)。Douette等（2005）研究了融合蛋白NusA-UCP1（uncouplingprotein1）的可溶產(chǎn)量。UCP1是一種線粒體膜蛋白。這些作者發(fā)現(xiàn)16℃培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)GroEL共過表達(dá)的情況下，融合蛋白的可溶性有更大的提高。這個(gè)結(jié)果也表明NusA與分子伴侶途徑相作用，從而阻止參與蛋白的聚集。
總結(jié)

已有充分的證據(jù)證明NusA標(biāo)簽系統(tǒng)能顯著提高多種不同來源蛋白的可溶性表達(dá)，而這些蛋白在單獨(dú)表達(dá)時(shí)往往形成不可溶的包涵體。在一些研究報(bào)告中，用蛋白酶切除NusA標(biāo)簽?zāi)苁鼓康牡鞍兹员３终_折疊和生物學(xué)活性；相反，在另外許多報(bào)道中也指出當(dāng)目的蛋白與NusA融合而非切除時(shí)，融合蛋白也同樣具有活性。NusA標(biāo)簽系統(tǒng)的成功至少部分地是由于其與大腸桿菌分子伴侶系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)
Cabrita, L.D., et al. 2006. BMC Biotechnol. 6, 12.
Compaan, D.M. and Ellington, W.R. 2003. J Exp. Biol. 206, 1545.
Davis, G.D., et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 65, 382.
De Marco, V., et al. 2004. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322,766.
Douette, P., et al. 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333,686.
Ermolova, N.V., et al. 2003. Protein Expr. Purif. 29, 123.
Guan, Z.B., et al. 2006. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 22, 46.
Houry, W.A., et al. 1999. Nature 402, 147.
Karlsen, O.A., et al. 2005. FEBS J 272, 2428.
Kohl, T., et al. 2008. Proteome Sci. 6, 4.
Korf, U., et al. 2005. Proteomics 5, 3571.
Kumar, S., et al. 2005. J Inverteb. Pathol. 88, 83.
Lack, G., et al. 2006. J Biol. Chem. 281, 9538.
Li, M. and He, S. 2006. J Biotechnol. 122, 334.
Li, M. and Huang, D. 2007. Biotechnol. Lett. 29, 1025.
Liu, W., et al. 2006. Plant Physiol. Biochem. 44, 284.
Magistrelli, G., et al. 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334,370.
Nallamsetty, S. and Waugh, D.S. 2006. Prot. Expr. Purif. 45,175.
Shih, Y.P., et al. 2002. Protein Sci. 11, 1714.
Turner, P., et al. 2005. Prot. Expr. Purif. 39, 54.
WilkInson, D.L and Harrison, R.G. 1991. Biotechnol. (N.Y.). 9,443.
Zheng, L., et al. 2003. J Biochem. 133,577.