pIB-VC156雙分子熒光互補(bǔ)載體

目前可以用于BiFC技術(shù)的熒光蛋白有YFP，GFP，BFP、CFP、Venus和mRFP等，本次介紹YFP和Venus熒光蛋白交叉的系統(tǒng)，即YN155 (YFP的第1-155位氨基酸，其中第YFP的第65位氨基酸由F突變?yōu)長(zhǎng)，該點(diǎn)突變促進(jìn)熒光蛋白的成熟)和VC156 (Venus的第156-239位氨基酸)配合使用的系統(tǒng)。該系統(tǒng)降低了假陽(yáng)性和假陰性線性現(xiàn)象。

　　載體信息

　　該系統(tǒng)包含兩個(gè)載體，即pIB-YN155 (載體示意圖，如圖2所示)和pIB-VC156 (載體示意圖，如圖3所示)，均由pIB-V5/His載體(載體示意圖，如圖4所示)改造而來(lái)。

pIB-YN155載體示意圖

圖2 pIB-YN155載體示意圖

pIB-VC156載體示意圖

圖3 pIB-VC156載體示意圖

pIB-V5/His載體示意圖

圖4 pIB-V5/His載體示意圖

　　重組載體的構(gòu)建

　　僅需要將待篩選的基因克隆到pIB-YN155和pIB-VC156載體上即可。嚴(yán)格意義上，每個(gè)基因需要同時(shí)構(gòu)建到上述兩個(gè)載體上。但是若只構(gòu)建到一個(gè)載體上，就足以檢測(cè)到互補(bǔ)熒光的產(chǎn)生，則可以不用構(gòu)建到另一個(gè)載體上。

　　克隆載體時(shí)候，要注意使用的酶切位點(diǎn)，確保插入的目基因與后面的YN155或者VC156的ORF對(duì)框，確保融合蛋白的正確翻譯。

　　共轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)，用熒光顯微鏡觀察熒光互補(bǔ)結(jié)果。

　　注意：本實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陰性對(duì)照。即用pIB-YN155和pIB-nVC156 (VC156的N端帶有atg，可以單獨(dú)表VC156蛋白)。利用熒光顯微鏡觀察時(shí)，需要調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度，在陰性對(duì)照組無(wú)熒光信號(hào)的情況下，觀察實(shí)驗(yàn)組的熒光信號(hào)。

　　BiFC優(yōu)缺點(diǎn)

　　BiFC優(yōu)點(diǎn)：

　　靈活：既能夠用于體內(nèi)相互作用的研究，也能夠用于體外相互作用的研究；

　　快速直觀：能夠在顯微鏡下直接觀察到相互作用結(jié)果；

　　適用性廣：BiFC系統(tǒng)已經(jīng)被成功應(yīng)用于動(dòng)物，植物，真菌和細(xì)菌等不同的宿主細(xì)胞中；

　　背景干凈，靈敏度高：驗(yàn)證結(jié)果只需檢測(cè)熒光的有無(wú)，背景干凈，靈敏度高；

　　能夠檢測(cè)弱相互作用及瞬時(shí)相互作用；

　　對(duì)儀器要求低，成本可控，數(shù)據(jù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單；

　　BiFC缺點(diǎn)

　　對(duì)溫度敏感：溫度高時(shí)片段間不易互補(bǔ)形成完整的熒光蛋白，這會(huì)對(duì)研究細(xì)胞在生理?xiàng)l件下的相互作用帶來(lái)負(fù)面影響（目前，只有基于venus、citrine和cerulean的BiFC系統(tǒng)可以在生理溫度條件下實(shí)現(xiàn)片段互補(bǔ)）；

　　信息滯后，無(wú)法隨時(shí)觀察：BiFC系統(tǒng)想要檢測(cè)到熒光，需要經(jīng)過(guò)兩個(gè)熒光蛋白片段互補(bǔ)重新形成完整的活性蛋白，以及熒光蛋白自體催化兩個(gè)過(guò)程，該過(guò)程往往需要幾分鐘到幾小時(shí)，因此觀察熒光信號(hào)滯后于蛋白質(zhì)的相互作用過(guò)程，不能實(shí)時(shí)地觀察相互作用過(guò)程；

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