pIB-YN155雙分子熒光互補載體

目前可以用于BiFC技術(shù)的熒光蛋白有YFP，GFP，BFP、CFP、Venus和mRFP等，本次介紹YFP和Venus熒光蛋白交叉的系統(tǒng)，即YN155 (YFP的第1-155位氨基酸，其中第YFP的第65位氨基酸由F突變?yōu)長，該點突變促進熒光蛋白的成熟)和VC156 (Venus的第156-239位氨基酸)配合使用的系統(tǒng)。該系統(tǒng)降低了假陽性和假陰性線性現(xiàn)象。

　　載體信息

　　該系統(tǒng)包含兩個載體，即pIB-YN155 (載體示意圖，如圖2所示)和pIB-VC156 (載體示意圖，如圖3所示)，均由pIB-V5/His載體(載體示意圖，如圖4所示)改造而來。

pIB-YN155載體示意圖

圖2 pIB-YN155載體示意圖

pIB-VC156載體示意圖

圖3 pIB-VC156載體示意圖

pIB-V5/His載體示意圖

圖4 pIB-V5/His載體示意圖

　　重組載體的構(gòu)建

　　僅需要將待篩選的基因克隆到pIB-YN155和pIB-VC156載體上即可。嚴格意義上，每個基因需要同時構(gòu)建到上述兩個載體上。但是若只構(gòu)建到一個載體上，就足以檢測到互補熒光的產(chǎn)生，則可以不用構(gòu)建到另一個載體上。

　　克隆載體時候，要注意使用的酶切位點，確保插入的目基因與后面的YN155或者VC156的ORF對框，確保融合蛋白的正確翻譯。

　　共轉(zhuǎn)染至同一細胞內(nèi)，用熒光顯微鏡觀察熒光互補結(jié)果。

　　注意：本實驗需要設(shè)置陰性對照。即用pIB-YN155和pIB-nVC156 (VC156的N端帶有atg，可以單獨表VC156蛋白)。利用熒光顯微鏡觀察時，需要調(diào)節(jié)熒光強度，在陰性對照組無熒光信號的情況下，觀察實驗組的熒光信號。

　　BiFC優(yōu)缺點

　　BiFC優(yōu)點：

　　靈活：既能夠用于體內(nèi)相互作用的研究，也能夠用于體外相互作用的研究；

　　快速直觀：能夠在顯微鏡下直接觀察到相互作用結(jié)果；

　　適用性廣：BiFC系統(tǒng)已經(jīng)被成功應(yīng)用于動物，植物，真菌和細菌等不同的宿主細胞中；

　　背景干凈，靈敏度高：驗證結(jié)果只需檢測熒光的有無，背景干凈，靈敏度高；

　　能夠檢測弱相互作用及瞬時相互作用；

　　對儀器要求低，成本可控，數(shù)據(jù)處理相對簡單；

　　BiFC缺點

　　對溫度敏感：溫度高時片段間不易互補形成完整的熒光蛋白，這會對研究細胞在生理條件下的相互作用帶來負面影響（目前，只有基于venus、citrine和cerulean的BiFC系統(tǒng)可以在生理溫度條件下實現(xiàn)片段互補）；

　　信息滯后，無法隨時觀察：BiFC系統(tǒng)想要檢測到熒光，需要經(jīng)過兩個熒光蛋白片段互補重新形成完整的活性蛋白，以及熒光蛋白自體催化兩個過程，該過程往往需要幾分鐘到幾小時，因此觀察熒光信號滯后于蛋白質(zhì)的相互作用過程，不能實時地觀察相互作用過程；

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