MaV203 Yeast strain/Competent cells酵母菌株/感受態(tài)細(xì)胞

MATa型，利用酵母體內(nèi)重組酶構(gòu)建質(zhì)粒的菌株.

產(chǎn)品規(guī)格

BioVector's MaV203 Competent Cells:                                        100μl/支            保存： -80℃（3個月）


BioVector's pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl               保存：-80℃（12個月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個月）


基因型

MATα, leu2-3,112; trp1-901; his3?200; ade2-101; cyh2R; can1R; gal4?; gal80?; GAL1::lacZ; HIS3UASGAL1:: HIS3 LYS2; SPAL10 UASGAL1::URA3





產(chǎn)品說明

BioVector's MaV203 菌株是利用酵母體內(nèi)重組酶構(gòu)建質(zhì)粒的菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化線性化質(zhì)粒和基因片段；可以用于篩選標(biāo)記為TRP，LEU，HIS，ADE的酵母質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。BioVector's MaV203 感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，BioVector's pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>106 cfu/μg DNA。






● PCR引物設(shè)計(jì)方法（例：BioVector's PGADT7質(zhì)粒Ecor1/Bamh1酶切線性化質(zhì)粒）

                       30-nt 同源序列               上游引物

5` --GAT  TAC  GCC  ATA  TGG  CCA  TGG  AGG  CCA  GTG   Gene specific sequences---3`                                                    質(zhì)粒序列



5` --GAT  TAC  GCC  ATA  TGG  CCA  TGG  AGG  CCA  GTG                                   GATCCAA  CGA  GCT  CGA  GCT  GCA  GAT  GAA  TCG  TAG--3`

3` --CTA  ATG  CGG  TAT  ACC  GGT  ACC  TCC  GGT  CACTTAA                                    GTT  GCT  CGA  GCT  CGA  CGT  CTA  CTT  AGC  ATC---5`



                                                                         3`---Gene specific sequences   GTT  GCT  CGA  GCT  CGA  CGT  CTA  CTT  AGC  ATC---5`



質(zhì)粒序列                                                                     下游引物               30-nt 同源序列


操作方法

1. 取100 μl冰上融化的BioVector's MaV203 感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 μg，Carrier DNA (95-100℃，2 min，快速冰浴，重復(fù)一次) 10 μl，PEG/LiAc 500 μl并吸打幾次混勻，30℃水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

2. 將離心管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH2O 400 μl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH2O 50 μl重懸，涂相應(yīng)的SD-/氨基酸缺陷型板，29℃培養(yǎng)48-96 h。

5. 平板長出的菌落做菌落PCR（為提高成功率，菌落PCR產(chǎn)物最好控制在300-500bp），PCR正確的菌落接菌提質(zhì)粒，酵母提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化高效率的商業(yè)化大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)（比如DH5a，TOP10等），再從大腸桿菌中提質(zhì)粒酶切或測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒放-20度可長期保存。




注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。

4. BioVector's MaV203 酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。

Supplier來源:BioVector NTCC Inc.
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