(一)什么是雙熒光素酶？

答：雙熒光素酶通常是指螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素。其中熒火蟲(chóng)熒光素是從甲蟲(chóng)（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa。這兩種酶的區(qū)別之一是他們的底物和輔因子不同：螢火蟲(chóng)熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時(shí)存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的區(qū)別之二是發(fā)光的顏色不同：螢火蟲(chóng)熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長(zhǎng)550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，它們的發(fā)光原理如下所示：

(二)為什么要采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)？

答：?jiǎn)螆?bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過(guò)共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。

(三)雙熒光素酶在miRNA驗(yàn)證其靶基因方面的原理是什么？

答：雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者沒(méi)有種源同源性并對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒(méi)有交叉干擾。得益于超強(qiáng)的光信號(hào)和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于 miRNA靶基因驗(yàn)證。 miRNA 主要通過(guò)作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以將目的基因 3’UTR 區(qū)域構(gòu)建至載體中報(bào)告基因 luciferase 的后面，通過(guò)比較過(guò)表達(dá)或者干擾 miRNA 后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化）可以定量反映 miRNA 對(duì)目的基因的抑制作用，也即用熒光值來(lái)判斷miRNA是否和靶基因結(jié)合。

(四)在利用雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA的靶基因方面，插入的3’UTR長(zhǎng)度應(yīng)該是多少？

答：靶基因的3’UTR長(zhǎng)度不一，將全長(zhǎng)都插入載體中不切實(shí)際，通常只插入包括miRNA結(jié)合位點(diǎn)前后200bp左右的序列，大概就是400bp[1]，但也有文獻(xiàn)插入的是80個(gè)bp[2]，有文獻(xiàn)選擇了200多個(gè)bp[3]，但嚴(yán)格來(lái)講，應(yīng)該選擇400bp，以結(jié)合位點(diǎn)為中心，上游200bp，下游200bp。

(五)常用的雙熒光素酶載體有哪些？

答：常用的載體有兩種策略。第一種是兩種熒光素分別位于兩個(gè)載體上，第二種是兩種熒光素酶位于同一個(gè)載體上。以第一種為例，這兩種載體分別為pMIR-REPORT miRNA載體和pRL-TK載體。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA載體是由Ambion開(kāi)發(fā)的載體，它用來(lái)克隆插入miRNA靶序列，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)miRNA功能的載體，該載體的圖譜如下所示：

另外的一個(gè)載體是pRL-TK載體，這個(gè)載體是由Promega開(kāi)發(fā)的，pRL-TK是海腎熒光素酶報(bào)告載體，含有SV40增強(qiáng)子，質(zhì)粒圖譜如下所示：

從這兩個(gè)圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，pMIR-REPORT miRNA這個(gè)載體主要是用于評(píng)估miRNA與靶基因3’UTR的結(jié)合，靶基因的3’UTR放在熒光素酶的后面，這個(gè)熒光素酶是熒火蟲(chóng)熒光素酶，而pRL-TK這個(gè)載體則表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來(lái)檢測(cè)熒光時(shí)，pRL-TK這個(gè)質(zhì)粒起到一個(gè)內(nèi)參的作用。

第二種方案就是將熒火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶構(gòu)建到一個(gè)載體上，這樣偏差更小，畢竟轉(zhuǎn)染一個(gè)質(zhì)粒比轉(zhuǎn)染兩個(gè)質(zhì)粒要容易，在這方面，根據(jù)檢索到的資料顯示，

pLuc2-MCS-RLuc-neo用于microRNA靶基因驗(yàn)證的雙熒光素酶載體，帶有RLuc和Luc雙熒光。該載體由Biovector保藏中心提供，圖譜如下所示：

phRluc-miR-Luc用于microRNA靶基因驗(yàn)證的雙熒光素酶載體 ，有BioVector保藏中心提供：

pmiRTarget-Luc-RLuc雙熒光素酶miRNA靶基因驗(yàn)證載體，miR靶標(biāo)3‘UTR插入在hLuc的c端MCS區(qū)。圖譜如下所示：

(六)在檢測(cè)miRNA靶基因時(shí)，需要設(shè)置多少個(gè)分組？

答：首先要知道，插入的靶基因原始3’UTR的質(zhì)粒叫野生型質(zhì)粒，除此之外，還需要在螢火蟲(chóng)熒光素酶3’UTR插入miRNA結(jié)合位點(diǎn)突變的序列載體，這個(gè)質(zhì)粒通常叫突變型質(zhì)粒，最后還有各種對(duì)照載體，包括螢火蟲(chóng)熒光素酶空載體，miRNA空載體，還有海腎素?zé)晒廨d體，以文獻(xiàn)中的案例 [4]說(shuō)明，此文獻(xiàn)使用了6組來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，其分組以及分組說(shuō)明如下所示：

注：pGL3是熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，綠色的是對(duì)照組，即不加miRNA質(zhì)粒，紅色的是正常組，加miRNA質(zhì)粒。思路即為熒光素酶質(zhì)粒（3種情況：①空質(zhì)粒；②加了WT靶基因3’UTR的質(zhì)粒；③加了MUT的靶基因3’UTR的質(zhì)粒）×miRNA precursor（兩種情況，即加與不加），經(jīng)排列組合，即為6組，詳細(xì)說(shuō)明如下所示：

理想結(jié)果：第四組降低，即miRNA能夠與靶基因的3UTR結(jié)合，第六組不變，即突變后靶基因3‘UTR不與miRNA結(jié)合。

(七)在檢測(cè)熒光方面，所使用的儀器是哪些？

答：最經(jīng)典的儀器就是Promega的GloMax 20/20 發(fā)光檢測(cè)儀。但也可以用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)（本實(shí)驗(yàn)室的儀器是VARIOSKAN LUX）。螢火蟲(chóng)熒光素酶產(chǎn)生的光顏色呈現(xiàn)黃綠色，波長(zhǎng)550-570nm；而海腎熒光素酶產(chǎn)生藍(lán)光，波長(zhǎng)480nm。

(八)測(cè)得結(jié)果的數(shù)據(jù)如何處理？

答：測(cè)得的結(jié)果一個(gè)螢火蟲(chóng)熒光素酶產(chǎn)生的光信號(hào)，記為RL1，，海腎熒光素酶產(chǎn)生的信號(hào)，記為RL2。RL1/RL2將數(shù)據(jù)均一化后，每?jī)山M之間用ANOVA檢測(cè)即可。

(九)參考資料

1. Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.

2. Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.

3. Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.

4. Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.